Diagnostica molecolare e sierologica dei microrganismi patogeni, Humanitas University

Iter diagnostico

Fase PREANALITICA
operazioni che iniziano dal prelievo:

• Richiesta di esami
• Raccolta del campione
• Conservazione e trasporto del campione
• Accettazione in laboratorio (check-in)

Fase ANALITICA
rappresenta la parte di effettiva esecuzione del test:

• Esecuzione dell'esame
• Validazione del risultato

Fase POST-ANALITICA

• Refertazione del risultato
• Consulenza

Ricerca genoma dei principali patogeni del SNC

ČR-RICERCA GENOMA DEI PRINCIPALI PATOGENI DEL SNČ
Esito
Positivo
Ricerca genoma E. coli K1 (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Haemophilus influenzae (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Listeria monocytogenes (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Neisseria meningitidis (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Streptococcus agalactiae (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Streptococcus pneumoniae (PCR)
Rilevato
Non rilevato
Ricerca genoma Cytomegalovirus (PCR)
Ricerca genoma Enterovirus (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Herpes simplex virus 1 (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Herpes simplex virus 2 (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Human herpesvirus 6 (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Human parechovirus (PCR)
Non rilevato
Ricerca genoma Varicella zoster virus (PCR)
Non rilevato
Ric. genoma Cryptococcus neoformans/gattii (PCR)
Non rilevato

Procedimento diagnostico

(Classico)
Procedimento
diagnostico
Campione biologico
campione
Assicurarsi di aver raccolto il
campione giusto, nel modo giusto, al
momento giusto
Identificazione
diretta
Identificazione
indiretta
Ricerca
antigene
Test molecolari
Sierologia
(IgG, IgM, IgA)
Saggi basati
sulla PCR
RT-PCR
(patogeno singolo)
Multiplex-PCR
(molti patogeni)

Identificazione diretta: diagnostica molecolare

Identificazione diretta:
diagnostica molecolare
Batteri
Virus
Test molecolari
Su campione
specifico
Funghi
Parassiti (protozoi)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Diagnostica molecolare:
Polymerase Chain Reaction (PCR)
La PCR è stata ideata da K. Mullis (Nobel
1993) nel 1983
· Ulteriormente affinata e sviluppata negli
anni successivi
· Impiegata in molti settori di ricerca e di
pratica clinica
· Rappresenta
il
sistema
che
ha
maggiormente consentito la diffusione
della diagnostica molecolare
nature
THE INTERNATIONAL WEEKLY JOURNAL OF SCIENCE
CHEMISTRY
NEW ELEMENT
Estavourium - discovered by
Prof. Extavour of U ef WI.Mas
PAGE 56
REWIND TO
O& THE PCR
BIOCHEMISTRY
NEW LAW O
OF SCIENCESCP
Kay Malha
Proof by De. Cindy Law
PADE 82
PARTURE COMINETE
KARY MULLIS
BALLANDO NUDI
NEL CAMPO
DELLA MENTE
LE IDEE (E LE AVVENTURE)
DEL PIÙ ECCENTRICO
TRA GLI SCIENZIATI
MODERNI

Tecnica di amplificazione in vitro

Polymerase Chain Reaction (PCR)
Tecnica di amplificazione in vitro che consente la sintesi esponenziale di un frammento di DNA a partire da
uno stampo del quale si conosce la sequenza nucleotidica delle regioni terminali
1st cycle
2nd cycle
3rd cycle
nth cycle
1
Denaturation
2
Annealing
3
Extension
DNA template
with sequence
of interest
3'
5
5'
3'
PCR product
3
5'
~20 copies
Primers
dNTPs
5'
3'
Polymerase
La PCR convenzionale è ancora utilizzata
da alcuni laboratori clinici in tutto il
mondo, ma viene rapidamente sostituita
da varianti più avanzate della tecnica.
✓
RT-PCR convenzionale
✓
Real Time PCR/ RT-rtPCR
✓
Transcription Mediated Amplification (TMA)
✓
Nucleic Acid Sequenze Based amplification (NASBA)
✓
LAMP/LAMP-RT

Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)

Diagnostica molecolare:
Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
La RT-PCR è stata progettata per amplificare i target
dell'RNA. In questa tecnica, la trascrittasi inversa
(RT) viene utilizzata per convertire i target dell'RNA
virale in DNA complementare (cDNA), quindi il
cDNA risultante viene amplificato mediante PCR
convenzionale

Processo di Reverse Transcription PCR

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
1 reverse transcription
(reverse transcribe of RNA to cDNA)
RNA template
5'
3'
I
5°
3'
primer
5°
3'
reverse
transcriptase
TT
1 L dNTPs
!
5°
3'
3'
5'
Complementary DNA
(cDNA)
2 amplification
(amplify of cDNA by PCR)
Complementary DNA
(cDNA)
5'
3'
3'
5'
cDNA amplification
with specific primers
using PCR technique
RT-PCR product
(amplified cDNA)

Real Time PCR

Diagnostica molecolare:
Real Time PCR
L'innovazione tecnologica della PCR è rappresentata dalla PCR Real Time, la metodica per
eccellenza nella quantificazione del DNA amplificato > diagnostica molecolare quantitativa
Si avvale di particolari strumenti che
uniscono
un
termociclatore
ad
un
fluorimetro
e
che
permettono
di
monitorare in tempo reale la quantità di
prodotto che si sta formando nella fase
esponenziale di amplificazione e di ottenere
così stime della concentrazione del DNA
bersaglio di partenza (PCR quantitativa).
La rivelazione del DNA amplificato avviene
tramite
l'utilizzo di particolari sonde
specifiche per i frammenti da amplificare
che generano segnali fluorescenti.
biosystems

Sonde TaqMan

Diagnostica molecolare:
Real Time PCR
Sonde TaqMan
Utilizzando
le apposite sonde
fluorogeniche TaqMan, ogni volta
che una sonda viene tagliata dalla
Taq polimerasi, si libera in soluzione
una molecola fluorescente che
genera il segnale rivelabile dal
detector.
R
Reporter dye
0
Quencher dye
R
Q
Probe
5'
R
O
3. Primer annealing
3'
Taq-polymerase
/
5'
Reporter dye emits
fluorescence
1. Denaturation
3'
®
Q
2. Probe annealing 3'
4. Extension and
cleavage of probe
3'

Quantificazione del DNA stampo

Diagnostica molecolare: Real Time PCR
50000
50000
45000 -
45000 -
Sample A
(1,000,000
DNA copies)
Sample B
(4,000 DNA
copies)
35000
35000 -
Fluorescence
30000 -
Fluorescence
30000
25000 -
20000 -
20000
15000 -
15000
Sample A has
a Ct of 20
Sample B has
a Ct of 28
More DNA
Less DNA
5000 -
Threshold level
5000-
to
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
5
10 15 20 25
30
35
40
45
Cycle number
Cycle number
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione e il relativo CT
(Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di DNA stampo
iniziale contenuto nel campione

Applicazioni della PCR Real Time

Real Time PCR: applicazioni
Le possibilità di applicazione della PCR Real Time nella diagnostica microbiologica sono
teoricamente illimitate. La rapidità con cui si ottiene il risultato e la possibilità di evidenziare
target diversi in contemporanea rendono questa tecnica indispensabile per la diagnosi
rapida delle infezioni:
v Indicazione per l'inizio della terapia e per la scelta del protocollo terapeutico
(batteri, funghi e parassiti)
V
Monitoraggio della risposta alla terapia (virus, in particolare nei p. oncologici)
v Rischio di progressione clinica associato alla carica virale (virus)
Singleplex reactions
Multiplex reaction
Gene
Primer set A
PCR with all
4 primer sets
(A, B, C, & D)
in a single
tube
A
-
Gene
1
1
B
Primer set C
Gene XIX XIX
c
=
Primer set D
Gene DA XIX XIX
D
XIX
I saggi monoplex (ricerca mirata di agenti
singoli) sono vantaggiosi in caso di indagine
mirata per forte sospetto clinico.
L'approccio
sindromico
ha stimolato lo
sviluppo di pannelli multiplex
(agenti
eziologici più probabili associate ad un
quadro sindromico).

Esempio: Virus

Real Time PCR: esempio: Virus
GeneXpert® Xpert® Xpress SARS-CoV-2/Flu/RSV (Cepheid)
GeneXpert.
Xpert Xpress CoV-2 plis
Xpert® Xpress CoV-2 plus
Xpert" Xpress CoV-2/Fiu/RSV plus
Gene Targets
SARS-COV-2
Flu A
Flu B
RSV
RdRP RNA-
M Matrix gene
M Matrix gene
RSV A
Nucleocapsid gene
dependent RNA
polymerase gene
E Envelope
protein gene
PB2 polymerase
basic protein 2 gene
NS non-structural
protein gene
RSV B
Nucleocapsid gene
N2 Nucleocapsid
gene
PA polymerase
acidic protein gene

Applicazioni: HPV

Real Time PCR: applicazioni: HPV
Alinity m High Risk (HR) HPV
Alinity m
HR HPV AMP Kit
AMP TRAY 4 x V96
ACT TRAY 4 x 96
Abbott
Abbott
------
2
LOF 173458
La rilevazione di 14 genotipi di HR HPV si ottiene con una
miscela di primer che ha per bersaglio una regione
conservata di genomi HPV e sonde DNA a filamento
singolo.
Il dosaggio identifica specificamente:
· genotipo HPV 16
· genotipo HPV 18
· genotipo HPV 45
rilevando allo stesso tempo gli altri genotipi ad alto
rischio:
· Gruppo A: 31/ 33/ 52/ 58
· Gruppo B: 35/ 39/ 51/ 56/ 59/ 66/ 68
Alinity
THE
ThinPrep
PAP TEST
PreseroCyt" Solution
Alinity

Applicazioni: Complicanze infettive post-trapianto

Real Time PCR: applicazioni:
Complicanze infettive post-trapianto: monitoraggio viremia da CMV
CMV Andilicatgr
R
Abbott RealTime CMV assay
Il test è destinato all'uso, insieme al quadro clinico e ad altri
marcatori di laboratorio, come indicatore dell'inizio di terapia e come
ausilio nel monitoraggio della risposta virale al trattamento antivirale
misurata dalle variazioni dei livelli di DNA nel plasma o nel sangue
intero.

Esempio: batteri

Real Time PCR: esempio: batteri
Xpert® SA Nasal Complete
S. aureus e MRSA preoperatorio in circa 65 minuti
GeneXpert
Xpert® SA Nasal Complete
123456789012345
12345678
Ceoheld
Xpert® C. difficile BT
Rilevamento dell'infezione da Clostridium difficile
45 minuti
GeneXpert
Xpert® C. difficile BT
123456789012345
12345678
Cepheid

Diagnostica molecolare

Diagnostica molecolare
Vantaggi
· MOLTO rapida
· Completamente automatizzato su
strumenti appositamente progettati
· Facile da usare
•
Disponibilità 24/7
Svantaggi
· Rileva solo gli agenti patogeni per i
quali i test sono progettati
· Bisogna scegliere il giusto test da
eseguire
· Rileva sia gli organismi "vivi" che
quelli "morti" (persistentemente
positivi anche dopo un trattamento
efficace)

Next-Generation Sequencing (NGS)

Next-Generation Sequencing (NGS)
GALTGAU
NGS
SATGATGCATGCO
AGATGCATGOGATCTA
AGATGCATGCGATCTAAL
TGCATGCGATCTAACGCT]
ICTAACGOTACTGACTGAC
FATCTAACGCTACTGACTG
TGATGCATGCGATCTAAG
TGCATGCGATCTAACH
SATGATGCATGOP
FTGACTGACTGACTGACTO
Sanger
· Consente di sequenziare moltissimi frammenti in parallelo, grandi genomi
. Tuttavia, l'uso di NGS nei laboratori clinici è limitato a causa dei lunghi tempi di
consegna, costo dei sequenziatori e requisiti di competenze in bioinformatica