Epigenetica, metilazione del DNA e analisi differenziale dell'espressione genica

Cos'è l'epigenetica?

L'epigenetica è lo studio di quei meccanismi che regolano l'attività dei geni senza cambiare la sequenza del DNA. Questi meccanismi possono essere ereditati (da una cellula madre a una figlia) e anche resettati (ad esempio nelle cellule uovo o spermatozoi).

Due principali meccanismi epigenetici:

• Modificazioni degli istoni (proteine attorno a cui si avvolge il DNA).
• Metilazione del DNA (di cui parliamo oggi).

Cos'è la metilazione del DNA?

È un processo in cui viene aggiunto un gruppo chimico - chiamato metile (CH2) - a una base del DNA: la citosina (C), in una specifica sequenza chiamata "CpG", cioè una C seguita da una G, unite da un legame fosfato (da qui la "p").

Alcuni numeri:

• Il genoma umano ha circa 1,5 miliardi di citosine.
• Circa 4-5% di queste sono metilate -> quindi circa 60 milioni.
• La metilazione avviene soprattutto nelle sequenze CpG, e 60-80% di queste CpG sono metilate.

Come si trasmette la metilazione quando una cellula si divide?

1. La sequenza CpG è palindromica: Significa che su entrambe le eliche del DNA ci sono una C e una G una di fronte all'altra (es: 5'-CG-3' su una elica, e 3'-GC-5' sull'altra).
2. Durante la replicazione del DNA: Il DNA si sdoppia. Dopo la duplicazione, una elica è vecchia (già metilata), l'altra è nuova (non ancora metilata). Questa situazione è detta "emi-metilata".
3. Chi interviene? Una proteina chiamata UHRF1 riconosce le sequenze emi-metilate. Chiama in aiuto una DNA metiltransferasi (DNMT1). DNMT1 metila la nuova elica nello stesso punto -> così la metilazione viene copiata correttamente.

Chi sono le DNA metiltransferasi (DNMT)?

Cosa fa la metilazione al DNA?

• Blocca l'attivazione dei geni. Il gruppo metile sporge nel solco maggiore del DNA (dove si legano i fattori di trascrizione). Questo ostacola o impedisce ai fattori di trascrizione di legarsi -> quindi il gene non viene attivato.
• Al contrario, può attrarre proteine specializzate che riconoscono il DNA metilato: le Methyl-Binding Proteins (MBP). Queste trasformano il DNA in eterocromatina (forma "chiusa", inattiva del DNA). Risultato: il gene non si esprime.

Cosa sono le isole CpG?

I dinucleotidi CpG dovrebbero essere frequenti, ma in realtà nel genoma sono molto meno del previsto. Questo perché le citosine metilate possono mutare facilmente in timina (T), causando una perdita di CpG nel tempo. Tuttavia, nelle regioni importanti come promotori o enhancer, queste CpG vengono conservate grazie alla selezione naturale. In queste zone si trovano gruppi di CpG chiamati "isole CpG":

• Sono ricche di CpG, a differenza del resto del genoma.
• Sono fondamentali per la regolazione genica.

Ricapitolando la metilazione del DNA

• La metilazione del DNA è una modifica epigenetica fondamentale per regolare l'attività dei geni.
• Agisce spegnendo i geni, specialmente se colpisce promotori o enhancer.
• È trasmessa da cellula a cellula durante la replicazione grazie alla proteina UHRF1 e all'enzima DNMT1.
• CpG sono più rare nel genoma perché mutano facilmente, ma vengono mantenute nelle regioni regolatorie chiave, dove formano le isole CpG.

CpG Islands (Isole CpG): cosa sono?

Sono piccole regioni del DNA (200-800 basi) dove ci sono molti dinucleotidi CpG, che altrove nel genoma sono rari.

Perché le isole CpG sono speciali?

Nel genoma, i CpG tendono a scomparire nel tempo (perché mutano facilmente). Ma nelle isole CpG non possono perdersi: se si perdessero, si perderebbe anche la regolazione dei geni. Quindi le isole CpG vengono conservate in zone importanti come promotori ed enhancer.

Caratteristiche principali delle isole CpG:

• Alta densità di CpG.
• Lunghezza: 200-800 basi.
• Rapporto tra CpG osservati/attesi ≥ 0,6.
• Circa il 60% dei geni umani ha un'isola CpG nel promotore (vicino all'inizio del gene).

Quando le isole CpG sono metilate o non metilate?

Perché metilare il corpo del gene?

Per impedire che si attivino falsi promotori interni (cioè che il gene venga attivato nel punto sbagliato). Se si toglie la metilazione da queste zone, la cellula potrebbe iniziare la trascrizione nel mezzo del gene: errore!

Come lavorano insieme DNA e istoni nella regolazione genica?

Processo di silenziamento:

• La lisina 9 dell'istone H3 (H3K9) viene deacetilata.
• Poi H3K9 viene metilata.
• Questa metilazione recluta la proteina HP1.
• HP1 recluta la DNA metiltransferasi, che metila il DNA in quella regione.
• Questo crea eterocromatina -> una forma compatta del DNA, non trascritta.

DNA e istoni si influenzano a vicenda:

• Metilazione del DNA -> porta alla metilazione degli istoni.
• Metilazione degli istoni -> può portare alla metilazione del DNA.

È un meccanismo di auto-renforzo: una volta iniziato il silenziamento, tende a mantenersi stabile nel tempo.

MeCP2 e la sindrome di Rett

Cos'è MeCP2?

È una proteina che si lega al DNA metilato e aiuta a mantenere le zone silenziate chiuse e non accessibili.

Cosa succede se manca MeCP2?

Non viene mantenuto il silenziamento genico corretto. Geni che non dovrebbero attivarsi nei neuroni cominciano a esprimersi -> disequilibrio tra cromatina attiva e inattiva.

Sindrome di Rett:

• Colpisce soprattutto le femmine (è una malattia legata al cromosoma X).
• I maschi con la mutazione muoiono prima della nascita.
• I sintomi compaiono tra 6 e 18 mesi: Perdita delle abilità acquisite. Problemi nel linguaggio e nel movimento. Comportamenti ripetitivi.

Come si studia la metilazione del DNA?

1. MeDIP (immunoprecipitazione del DNA metilato)

• Si usa un anticorpo che riconosce solo le citosine metilate.
• Il DNA viene frammentato e le parti metilate vengono "tirate fuori".
• Poi si sequenzia.
• Mostra dove ci sono regioni metilate, ma non a livello di singola base.

2. Metodo del bisolfito (sequenziamento bisolfito)

• Il DNA viene trattato con bisolfito di sodio: Le citosine non metilate diventano uracile (poi timina). Le citosine metilate restano invariate.
• Poi si sequenzia il DNA -> si vede base per base quali C erano metilate.

Quando avviene la metilazione e la demetilazione?

Durante lo sviluppo embrionale:

• Fecondazione: lo spermatozoo entra nell'uovo -> si forma lo zigote.
• Avviene una riprogrammazione epigenetica: Tutti i pattern di metilazione vengono cancellati. Poi vengono ristabiliti, secondo il tipo di cellula che si svilupperà.
• Serve a resettare le istruzioni per permettere allo zigote di svilupparsi correttamente.

Ricapitolando tutto sulla metilazione

• Le isole CpG sono regioni ricche di CpG dove è importante mantenere il controllo dei geni.
• CpG metilate = gene spento; non metilate = gene acceso.
• MeCP2 è essenziale per mantenere il silenziamento -> la sua assenza causa la sindrome di Rett.
• DNA e istoni lavorano insieme per silenziamento stabile o attivazione duratura.
• Ci sono tecniche per studiare la metilazione: MeDIP e sequenziamento bisolfito.
• La metilazione cambia durante lo sviluppo, permettendo alle cellule di "decidere cosa diventare".

COSA SONO METILAZIONE E DEMETILAZIONE?

Metilazione del DNA: è l'aggiunta di un gruppo chimico (gruppo metile, -CH2) a una base del DNA (in particolare alla citosina nelle regioni CpG). Questo di solito "spegne" i geni, impedendo che vengano espressi. Demetilazione: è la rimozione di questo gruppo metile. Può essere:

• Passiva: avviene quando il DNA si duplica ma i gruppi metili non vengono aggiunti alla copia.
• Attiva: avviene con l'intervento di enzimi che modificano direttamente la metilcitosina.

FASI DEI CICLI DI METILAZIONE NELLO SVILUPPO

1. Gametogenesi (Formazione dei gameti)

• Durante la spermatogenesi, gli spermatozoi perdono gli istoni e c'è una forte demetilazione del DNA.
• Anche il DNA dell'ovocita, ereditato dalla madre, viene demetilato.
• Quindi sia il DNA paterno che quello materno vengono quasi completamente "azzerati" a livello epigenetico.

2. Fecondazione e prime fasi dello sviluppo

• Dopo la fecondazione, si forma lo zigote.
• Quando si arriva allo stadio di blastocisti (circa 5-6 giorni dopo la fecondazione), inizia una nuova ondata di rimetilazione, che stabilisce i pattern epigenetici dell'organismo.

3. Cellule germinali primordiali

• Queste sono le cellule che daranno origine a ovociti e spermatozoi.
• Subiscono un'altra ondata di demetilazione e poi una di rimetilazione, creando il pattern specifico per i gameti.

DIFFERENZE TRA MASCHI E FEMMINE

Nei maschi:

• La rimetilazione avviene prima della nascita, verso la 15a settimana.
• Le cellule germinali maschili raggiungono un livello di metilazione simile a quello iniziale.

Nelle femmine:

• La rimetilazione avviene dopo la nascita, quando le cellule germinali (che non sono ancora ovociti maturi) iniziano a maturare in ogni ciclo mestruale.
• Ad ogni ciclo, il pattern di metilazione cambia.

COME AVVIENE LA DEMETILAZIONE ATTIVA?

Enzimi chiamati TET1, TET2, TET3:

• Modificano la 5-metilcitosina in 5-idrossimetilcitosina.
• Questa può essere ulteriormente modificata in: 5-formilcitosina 5-carbossicitosina
• Questi residui vengono poi rimossi da sistemi di riparazione del DNA, e la base viene sostituita con una citosina normale -> DNA demetilato!

PERCHÉ È IMPORTANTE TUTTO QUESTO?

Anche se il DNA (genetica) è lo stesso in tutte le cellule, l'epigenetica (cioè la metilazione) cambia da cellula a cellula e da individuo a individuo. Ci sono geni che devono essere espressi solo dalla madre o solo dal padre (fenomeno chiamato imprinting genomico). Se un gene è metilato -> non viene espresso. Questo fa sì che circa l'1% dei geni abbia espressione diversa a seconda se viene dalla madre o dal padre. È per questo che i neonati assomigliano spesso di più al padre a livello di trascrizione genica, anche se il DNA è al 50% da entrambi.

COME SI STUDIA LA METILAZIONE?

Si usano trattamenti chimici come il bisolfito, che trasforma le citosine non metilate in timine, permettendo di vedere quali sono metilate. Per distinguere tra i diversi derivati della metilcitosina (idrossi, formil, carbossi), si possono usare enzimi batterici che metilano tutte le citosine: così si capisce meglio dove e quanto è modificato il DNA.

RIMETILAZIONE CONTINUA

Nei geni attivi, c'è un continuo ciclo di demetilazione e rimetilazione nei promotori. Questo è un meccanismo regolativo importante per accendere o spegnere i geni.