Genetica applicata e patologia molecolare in oncologia: domande e tecniche

Domande

Gli argomenti sono evidenziati nel testo

• Stadiazione TNM, grading, TRG definizioni
• Biomarcatori: definizione, tipologie, esempi di biomarcatori
• Mutazioni genetiche: tipologie (cromosomiche/a singola base), mutazioni in oncologia: driver e passenger, esempi di mutazioni con ruolo oncologico (ERBB2, EGFR, BRAF)
• Differenza tra mutazioni somatiche e germinali, esempi di mutazioni germinali e sindromi ad esse correlate (BRCA1/2: TP53: Ly Fraumeni; MMR: Lynch; APC: FAP; CDH1: HDGC)
• Estrazione di acidi nucleici: DNA e RNA, preanalitica, selezione, fasi dell'estrazione, metodi di estrazione, differenze tra DNA e RNA
• Sequenziamento Sanger: a cosa serve, come si esegue
• NGS: cos'è, a cosa serve, tipologie di analiti: DNA/RNA, differenze tra WGS e target sequencing, quali DNA-microArray a cosa serve, come funziona piattaforme NGS si possono usare
• Array CGH a cosa serve, come funziona qPCR applicazioni, come funziona
• Analisi automatizzate in oncologia molecolare: piattaforma Idylla, come funziona, che tipo di saggi posso eseguire
• Fusioni geniche: che cosa sono, esempi di fusioni geniche frequenti in oncologia (ALK/ROS/NTRK: carcinoma del polmone; FGFR2 colangiocarcinoma), metodiche per rilevarle (RTgPCR, NGS, FISH)
• In situ hybridization: FISH, a cosa serve, come si esegue, che tipo di sonde si possono usare e come la scelta della sonda influenza il risultato finale
• Epigenetica: cos'è, ruolo della metilazione nella diagnostica molecolare oncologica: MGMT e MLH1, tecniche per lo studio della metilazione: conversione con bisolfito e successive analisi (sequenziamento, pirosequenziamento, High resolution melting)
• Biopsia liquida: cos'è, a cosa serve, che analiti posso vedere, che campioni posso analizzare, ruolo della preanalitica in LB, tecniche per lo studio della LB (qPCR, NGS, digital PCR), applicazioni LB: carcinoma del polmone
• Marcatori genetici in CRC (MSI, geni RAS, EGFR, BRAF, ERBB2)
• Marcatori del carcinoma gastrico (HER-2, PD-L1, claudina)
• Marcatori del colangiocarcinoma (FGFR2, IDH1/2)
• Marcatori del carcinoma della mammella (HER-2, BRCA1/2, PIK3CA)
• Marcatori del carcinoma duttale del pancreas
• Marcatori del carcinoma dell'endometrio
• Marcatori del carcinoma della tiroide
• Marcatori del glioblastoma
• Marcatori del carcinoma del polmone (EGFR)

Tecniche di genetica applicata

Patologia molecolare -> studio di alterazioni di acidi nucleici associate a patologie (utile specialmente in oncologia). Ha interesse diagnostico, prognostico e terapeutico. Come sono rilevabili tali alterazioni? Tramite metodiche di biologia molecolare.Genetica: studio del DNA -> applicata sia a malattie ereditarie che neoplastiche malattia: non funzionamento delle unità costituenti l'organo (cellule) -> non funzionamento del DNA Quindi danni o alterazioni del DNA causano una patologia, interazione oggetto di studio della patologia molecolare. Anche alterazioni dell'RNA possono causare l'insorgere di una patologia. Ad oggi è fondamentale conoscere le caratteristiche genetiche di una neoplasia per valutarne aspetti e possibili iter terapeutici.

Struttura del referto

Come si struttura un referto? 1997: informazioni relative alla sola istologia (istotipo, grading, metastasi, margini di resezione) 2022: informazioni relative all'istologia (+ invasione vascolare/perineurale, tumor regression grading) e alla caratterizzazione immunofenotipica

Grading

GRADING (grado di differenziazione): definisce quanto la neoplasia si discosta, nel suo aspetto istologico, dal tessuto normale da cui ha preso origine 1 ben differenziato/differenziato 2 moderatamente differenziato 3 scarsamente differenziato 4 indifferenziato (grado più aggressivo)

Stadiazione TNM

Stadiazione TNM: sistema di classificazione sintetico e standardizzato che consente di esprimere l'estensione anatomica della malattia - Guida nella scelta del trattamento - Facilita la determinazione della prognosi - Aiuta a valutare l'efficacia dei trattamenti Il sistema TNM è universalmente accettato, si basa sulla valutazione di tre parametri T: estensione, dimensioni del tumore primitivo e rapporto con altri organi (Tis, T1, T2, T3,T4) N: assenza o presenza ed estensione di malattia ai linfonodi loco-regionali (N0, N1, N2, N3). Il numero dei linfonodi totali repertati assume un importante ruolo di controllo della qualità della stadiazione. M: assenza o presenza di metastasi a distanza (M0, M1), associato a numeri che indicano il grado di estensione della neoplasia La classificazione TNM consente di definire 4 stadi: 0 (cancro in situ, limitata estensione), 2-3 estensione loco regionale, 4 (metastasi a distanza) Invasione perineurale (PNI) Descrivere la presenza di cellule tumorali attaccate a un nervo. (Ruolo prognostico)

Tumor Regression Grading (TRG)

Tumor Regression Grading (TRG) Definisce il grado di regressione della malattia, dopo trattamento neoadiuvante, in genere si definisce valutando il residuo di cellule tumorali in relazione al tessuto fibroso. Indicato in ogni referto post-terapia neoadiuvante. Diverse classificazioni: Mandard, Becker, Dworak, or Rödel 1 Regressione completa: Fibrosi senza tessuto tumorale rilevabile; 2 Fibrosi con cellule tumorali frammentate 3 Fibrosi e cellule tumorali con preponderanza di fibrosi 4 Fibrosi e cellule tumorali con preponderanza di cellule tumorali 5 Tumore senza segni di regressione

Patologia molecolare

La patologia molecolare nasce dall'unione delle tecniche di anatomia patologica e delle tecniche di biologia molecolare. Ciò determina un'ampia gamma di impieghi in cui è coinvolta questa scienza e un'ampia gamma di materiale impiegato per essa. Collaborazione di più figure professionali: patologo, biologo, tlb e oncologo. La combinazione di valutazioni istologiche, immunoistochimiche e di patologia molecolare consente di perfezionare la diagnosi e di conseguenza la prognosi, ma anche di indirizzare una terapia target.

Ruolo del patologo

Ruolo del patologo STROMA: tessuto che sostiene il tumore, vasi sanguigni (cellule endoteliali: EC), cellule del sistema immunitario, Cellule infiammatorie (granulociti, monociti, macrofagi), cellule connettivali (es. fibroblasti: CAF); matrice extracellulare del tumore (ECM), che può contenere fattori di crescita. - valutazione dell'adeguatezza del campione - valuta il rapporto tra le cellule neoplastiche e le cellule dello stroma, stimando la percentuale neoplastica (su ematossilina eosina) - seleziona le zone di interesse per l'analisi molecolare (la selezione può essere entro certi limiti operatore dipendente) Selezione: individuare un'area della fetta con una buona presenza rappresentativa di neoplasia con lo scopo di ottenere una maggiore resa all'analisi molecolare.

Biomarcatori

Biomarcatori (es BRCA1, BRCA2) Un biomarcatore è una caratteristica oggettivamente misurabile e valutata come indicatore di un processo biologico fisiologico, di uno stato patologico, o della risposta ad un intervento terapeutico. Biomarcatori diagnostici: per riconoscere uno stato di malattia conclamata e sono usati per sviluppare saggi non invasivi che indichino l'insorgenza di una determinata patologia Biomarcatori prognostici: in grado di predire il futuro della patologia Biomarcatori predittivi: forniscono informazioni riguardo l'effetto di un intervento terapeutico

Caratteristiche dei biomarcatori

Caratteristiche - deve poter essere misurato con precisione, in modo affidabile e in tempi rapidi - accettato dal paziente - facile da analizzare, possibilmente con procedure automatizzate - possibilità di standardizzare l'analisi e di fissare range sulla base di sesso, età, etnia delle diverse coorti testate - basso costo o rapporto costo/beneficio favorevole

Marcatori tumorali

Marcatori tumorali Sostanze prodotte dal tumore o dall'ospite in risposta alla presenza del tumore. Si possono trovare nelle cellule, nei tessuti o nei fluidi corporei. Marcatore ideale è specifico per un determinato tipo di tumore, non è presente in condizioni benigne. Diverse tipologie di marcatori: Enzimi (es. PSA) Ormoni (calcitonina) Proteine (CEA) ACIDI NUCLEICI (DNA/RNA/microRNA)

Medicina di precisione

Medicina di precisione La medicina di precisione (medicina personalizzata) è un nuovo approccio alle malattie che tiene conto della variabilità individuale in termini di patrimonio genetico, ambiente e stile di vita, per stabilire le opportune strategie cliniche da attuare per ogni paziente. Lo scopo è quello ottenere un approccio più preciso nella gestione del paziente. Non riguarda il solo trattamento del paziente ma anche le procedure diagnostiche e la prevenzione. La prevenzione è un insieme di misure utili a prevenire la comparsa, la diffusione e la progressione delle malattie e/o lo sviluppo di danni irreversibili quando la patologia è in atto.

Tipi di prevenzione

Prevenzione primaria (destinatario: soggetto sano) comprende tutti gli interventi destinati ad ostacolare l'insorgenza delle malattie nella popolazione, riducendo le cause e i fattori predisponenti. Strumenti: campagne informative/sensibilizzazione, profilassi (vaccinazione), correzione degli stili di vita. Prevenzione secondaria: individuazione precoce dei soggetti ammalati o ad alto rischio per poter ottenere la guarigione o impedire l'insorgenza e la progressione della malattia. Strumenti: screening. Prevenzione Terziaria: mira a ridurre la gravità e le complicanze di malattie ormai instaurate.

Progetto Genoma Umano

Progetto Genoma Umano Obiettivo: identificare e mappare i geni del genoma umano 1990-2003 20-25000 geni per genoma umano 1,5% geni, 36% Introni, UTR, Pseudogeni, frammenti genici La rimanenza è DNA intergenico, sequenze ripetute in tandem anche dette microsatelliti (3%)

Progetto Genoma Cancro

Progetto Genoma Cancro 38 tipi di tumore Mediamente ogni genoma tumorale contiene 4-5 mutazioni 'driver' Nel 5% dei casi non sono state identificate mutazioni 'driver' (Epigenetica)? Alla base delle neoplasia ci sono normalmente alterazioni del DNA, ma ci sono tumori che non presentano anomalie genetiche. Ciò sottolinea l'importanza dello studio dei meccanismi che da DNA producono la proteina. Geni più frequentemente mutati nei tumori: TP53 (36.6%) MUC16 (18.9%), PIK3CA (12.4%) Il gene TP53 è il gene più mutato (1/3 dei casi di neoplasia presentano alterazioni a carico di questo gene). Esistono quindi geni più frequentemente mutati, che non sono però specifici di una singola neoplasia. Più tipologie di tumore possono essere associate quindi a un singolo gene. Una singola neoplasia può avere più mutazioni, che tendono infatti ad accumularsi. Il cancro è un processo evolutivo, le mutazioni avvengono in modo casuale, il loro accumulo e selezione le rende più maligne.

Mutazioni 'passenger' e 'driver'

Mutazione 'passenger': mutazione che NON conferisce un vantaggio selettivo alle cellule che la presentano. Mutazione 'driver': mutazione che conferisce un vantaggio selettivo alle cellule che la presentano (favoriscono la crescita). Avvengono soprattutto a livello di: - Regioni che codificano per proteine - Siti di splicing - Promotore del gene Possono coinvolgere oncogeni (mutazioni missense, duplicazioni) o geni oncosoppressori (delezioni, frameshift, nonsense) Proto-oncogene-> oncogene: Fattori di crescita (PDGF) stimolano la proliferazione di cellule bersaglio, Recettori dei fattori di crescita (ERBB, ERBB-2, KIT, MET, RET, ROS): trasmettono le informazioni attraverso la membrana cellulare, Trasduttori di segnale (HRAS, KRAS, NRAS) aiutano a trasferire le informazioni, per esempio dai recettori posti sulle membrane delle cellule fino al nucleo. Fattori di trascrizione (C-MYC): regolano l'espressione di geni bersaglio o famiglie di geni. Regolatori dell'apoptosi (BCL-2): coinvolti nei processi di morte programmata delle cellule. Oncosoppressore: geni coinvolti in genere nella divisione cellulare, nella riparazione degli errori che si possono generare nel DNA e nei processi di apoptosi (es TP53)