Stafilococchi e streptococchi: patogenicità, tossine e diagnosi in Biologia

Lezione 14, 24-03-22

Microbiologia (Marangoni) Mormando, Nardoni, Proni

Stafilococchi

IMPORTANTE PER ESAME: stafilococchi e streptococchi sono due domande classiche, specialmente per "rompere il ghiaccio" Gli stafilococchi sono cocchi disposti a grappolo, appartenenti al gruppo dei Gram-positivi che producono molti enzimi e varie tossine. Si trovano ovunque: sono ambientali e fanno parte del microbiota umano (cute e mucose interne) e di quello animale. Sono batteri particolarmente resistenti e non tutti sono patogeni per l'uomo. Quello più dotato di caratteristiche patogene è lo Staphylococcus aureus, che prende questo nome dalla colorazione giallo-oro che presenta sulle colture di agar sangue. In più questo batterio è capace di far virare verso il giallo il terreno agar sale-mannite. Gli stafilococchi possono essere suddivisi in base alla capacità di possedere o meno l'enzima coagulasi: solo S. aureus è coagulasi positivo, mentre tutti gli altri sono coagulasi negativi Alcuni esempi di stafilococchi coagulasi negativi sono S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. hoemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. saccharolyticus, S. auricolaris, ecc. (integrazione dalle diapositive)

Staphylococcus Aureus

S. aureus è molto diffuso nella popolazione; sono molti i portatori sani che possono diffondere l'infezione. Fa parte del microbiota della cute, ma anche di quello vaginale (a volte) e di quello delle alte vie respiratorie. La maggior parte delle infezioni è dovuta o a contatto diretto con materiale infetto o a contatto con oggetti contaminati. Si parla inoltre di contatto tramite goccioline (droplets) nel caso in cui il batterio entri a far parte delle alte vie aeree. Per i ceppi in grado di produrre enterotossine sono possibili anche tossinfezioni alimentari per ingestione di cibo contaminato.

Infezioni causate da S. aureus

Si tratta generalmente di infezioni piogeniche: si ha una forte infiammazione, con conseguente richiamo di polimorfonucleati, neutrofili e un'importante produzione di pus. All'infiammazione fa seguito il rilascio di citochine. Oltre alla cute e ai tessuti molli S.aureus può colpire tanti altri distretti causando artriti o osteomieliti (infezioni a carico dell'apparato muscolo scheletrico), endocarditi e infezioni a livello di rene e tratto urinario inferiore. Ci sono inoltre stipiti che producono particolari tossine. Tra questi, un ceppo produce la tossina dello shock tossico che causa un'infezione e multisistemica molto grave e caratterizzata da alta mortalità.

Antigeni e fattori di patogenicità

S.aureus "è nato" per essere patogeno proprio perché ha tanti fattori di patogenicità:

• proteina A: sulla parete, si lega alla regione costante degli anticorpi di classe G
• proteina che lega fibronectina
• produce tossine con attività citolitica
• produce l'enzima coagulasi (a differenza degli altri)
• come gli altri stafilococchi produce catalasi . spesso sintetizza ialuronidasi per degradare l'acido ialuronico
• non S. aureus, ma S.epidermidis produce materiale mucoso in eccesso per aderire meglio alle superfici (biofilm)

Alcuni ceppi di s.aureus producono tossine che funzionano come superantigeni. Esse si legano sul complesso MHC di classe II delle cellule APC, stimolando i linfociti T a produrre una serie di citochine pro- infiammatorie che causano shock tossico. Questa situazione è multi sistemica e può compromettere in maniera fatale la vita del paziente.

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Altri fattori di patogenicità degli stafilococchi

Altri fattori di patogenicità degli stafilococchi sono legati a:

• capsula: come tutti i batteri capsulati sono difficili da fagocitare, possono contribuire a produrre biofilm, possono abbassare la resistenza agli antibiotici ecc.
• clumping factor: è una proteina che si lega al fibrinogeno causandone l'aggregazione.

Enzimi

• coagulasi: è un enzima che trasforma il fibrinogeno in fibrina formando un coagulo. All'interno del coagulo il batterio risulta meno riconoscibile dal sistema immunitario e viene fagocitato con più difficoltà. In laboratorio si può sfruttare questa capacità per riconoscere lo S.aureus.
• catalasi (presente anche in altri stafilococchi): degrada il perossido d'idrogeno in acqua, permettendo di evadere il killing all'interno dei macrofagi.
• lipasi: idrolizza trigliceridi e fosfolipidi. Questo enzima è molto importante per la crescita e la diffusione nelle zone sebacee. Inoltre permette la crescita su alimenti ricchi di lipidi (soprattutto panne e creme) di quei ceppi di S.aureus che causano le tossinfezioni alimentari.
• ialuronidasi: scinde l'acido ialuronico favorendo l'inserimento nel tessuto connettivo.
• nucleasi: idrolizzano RNA e DNA in presenza di calcio. Probabile ruolo nel fluidificare il materiale purulento e favorire la diffusione del batterio.
• proteasi, ureasi, superossidodismutasi, esterasi, fosfatasi

Ha tante caratteristiche per evadere il sistema immunitario e invadere i tessuti.

Tossine

In alcuni stafilococchi sono prodotte specifiche tossine. A seconda del ceppo che causa infezione si può trovare un pattern diverso di tossine. Tra le più rilevanti ci sono:

• emolisine: sono le più frequenti e ne esistono diversi tipi.
• tossina delta: causa dei pori nella membrana dei globuli rossi.
• leucocidina: una volta era abbastanza rara (la si trovava in meno nell'1% dei ceppi), ora invece si trova nel 5% dei ceppi. È tossica per i leucociti.
• tossina epidermolitica (esfoliatina): prodotta da un numero limitato di ceppi. Causa la "sindrome della cute ustionata", una sindrome severa (può portare anche alla morte) che colpisce soprattutto neonati e immunocompromessi. Provoca il distacco di zone molto ampie dello strato superficiale dell'epidermide. Specificatamente rompe i legami a livello dei desmosomi, facendo in modo che la cute si esfoli e lasci delle zone sottostanti simili a ustioni. Poiché questa sindrome è causata dalla tossina, che è capace di diffondere per via ematica, la localizzazione del batterio è ininfluente. Dunque lo stafilococco può trovarsi in tutt'altro sito rispetto a quello interessato dalla cute ustionata. Tra l'altro la produzione della tossina può essere data da geni del cromosoma o del plasmide, in questo caso può essere trasferita anche ad altri stafilococchi.
• enterotossina: causa sindromi meno gravi. Anche in questo caso la codifica è dovuta a geni o sul cromosoma o sul plasmide e spesso sono geni trasferiti da fagi. L'intossicazione è data dall'ingestione della tossina e non dalla replicazione degli stafilococchi a livello intestinale. Gli alimenti maggiormente interessati sono quelli lipidici che permettono la moltiplicazione degli stafilococchi (che posseggono la lipasi). Queste tossine sono termoresistenti e riescono a resistere anche ai succhi gastrici. Hanno un'azione emetica: causano vomito e talvolta diarrea in tempi molto rapidi, che non rispondono bene alle terapie. Hanno comunque un esito benigno, sono autoresolventi.
• tossina dello shock tossico (TSST-1): prodotta da una parte minoritaria di stafilococchi. Si lega a cellule presentanti l'antigene a livello delle MHC di classe II e va a stimolare in maniera permanente i linfociti T, provocando un rilascio massiccio di citochine pro-infiammatorie che sono responsabili dello shock tossico, che causa disfunzione multiorgano. Questa sindrome fu riconosciuta per la prima volta negli anni settanta in donne che facevano uso di tamponi interni durante il mestruo. Fortunatamente la tossina è a controllo cromosomico, altrimenti sarebbe molto più diffusa tra gli stafilococchi.

In sostanza, S.aureus può causare vari tipi di quadri. I fattori di patogenicità sono legati al fatto di avere la capsula e al poter produrre determinati enzimi e tossine. Proprio in virtù di tutto ciò, bisogna porre molta attenzione affinché si eviti la diffusione di questo batterio nei reparti considerati più a rischio. Nel 20% dei soggetti rientra nel normale microbiota cutaneo, bisogna che ci sia molta attenzione da parte del personale sanitario a non trasferirlo a soggetti fragili, in particolare nel caso in cui l'operatore abbia sulla cute un foruncolo, ascesso o favo che possa far pensare a una replicazione massiccia in loco di S.aureus. Questo perche il soggetto sano ha un'infezione localizzata e banale, se però infetta una ferita chirurgica o un catetere può portare a quadri molto più gravi.

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Diagnosi di laboratorio

Lo stafilococco, come già sottolineato, nella maggior parte dei casi causa infezioni piogeniche. Quindi, anche negli ascessi c'è una produzione importante di pus che può essere raccolto durante la pulizia chirurgica oppure, se presente sulla cute, mediante un tampone. Da precisare però che il campione che verrà analizzato in laboratorio può essere dei più vari: una biopsia ossea se si sospetta un'osteomielite o del liquido sinoviale se si teme un'artrite settica. Una volta ottenuto il materiale patologico, la presenza si S.aureus si può rilevare tramite esame al microscopio ottico: il vetrino è pieno di cocchi Gram-positivi disposti a grappolo. Oppure si fa una coltura su agar sangue, ma ancor di più su agar sale-mannite, perché gli stafilococchi sono alofili, riescono a crescere in concentrazioni molto elevate di sali (7%, molto diverso dallo 0,9% della soluzione fisiologica). In più in questo terreno si può distinguere uno stafilococco non aureus da uno S.aureus, in quanto quest'ultimo crescendo metabolizza la mannite, facendo virare il colore del terreno dal rosa normale verso il giallo per un abbassamento del pH. 2 top do. In questa foto nel terreno rosa c'è uno stafilococco non aureo; invec, a sinistra si vede una piastra che mostra crescita di colonie con il terreno che sta diventando giallo, indice della presenza di S.aureus.

Identificazione di Staphylococcus aureus

Per l'identificazione si usa soprattutto il MALDI-TOF (spettrometria di massa). Le colonie si possono però saggiare per vedere se producono alcuni enzimi. Ad esempio, lo stafilococco è sempre catalasi positivo. Ciò vuol dire che se si aggiunge acqua ossigenata sulle colonie, queste formano bolle di ossigeno. Si dice che cominciano a "friggere" proprio a causa del rumore dell'ossigeno che viene liberato. Al contrario, se si aggiunge acqua ossigenata a colture non appartenenti al genere stafilococco non si ha nessuna modifica. (immagine in alto) Se si vuole discriminare S.aureus dagli altri stafilococchi si può fare la prova della coagulasi, in quanto solo l'aureo ha questo enzima. Quindi, se si pone plasma animale nelle colonie con S.aureus si formerà un coagulo. (immagine in basso)

Terapia e profilassi

S.aureus ha iniziato con il tempo a manifestare importanti resistenze; perciò quando viene identificato è importante procedere con un antibiogramma per capire se si è di fronte a uno stafilococco comunque sensibile o ad uno che presenta spiccate resistenze. Dagli anni '80-'90 la maggior parte degli S.aureus (soprattutto quelli isolati in ospedale) sono resistenti alle penicilline di vecchia generazione. Purtroppo però questi batteri stanno iniziando a mostrare resistenza anche a beta lattamici più moderni come la meticillina. Infatti tra gli stafilococchi bisogna porre la massima attenzione agli MRSA, (methicillin resistant Staphylococcus aureus) che tra l'altro si iniziano a isolare anche in soggetti non ricoverati. Se la meticillina non è efficace, la seconda linea è rappresentata dalla vancomicina. Nell'immagine (pagina seguente) si può vedere un piccolo riassunto della storia delle resistenze: dopo l'introduzione delle prime penicilline sono emersi ceppi resistenti alle penicilline naturali. Per quanto riguarda quelle sintetiche (su tutte la meticillina che ha un anello lattamico protetto da un ulteriore gruppo chimico) le prime resistenze si sono mostrate attorno agli anni novanta. Si sottolinea anche che la media europea dei ceppi isolati di S.aureus registra un 9-10% di ceppi resistenti alla meticillina. In Italia purtroppo siamo al 40%. Considerando soprattutto S.aureus si può individuare una sorta di gradiente: l'antibiotico resistenza è minore nei paesi scandinavi, per poi aumentare in quelli del sud.

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