Spettrometria di massa accoppiata: principi e applicazioni

SPETTROMETRIA DI MASSA ACCOPPIATA

Prof. Magni - Data Lezione (09/03/2020) - Autore sbobina: Serena Benetti - Revisore: Alessia Porta

Questa lezione andrà ad investigare altre opportunità che la MS offre. Nell'immagine sono descritte le varie parti e che tipo di modalità ci sono nello spettrometro di massa, viste nelle scorse lezioni. Abbiamo visto che il risultato grezzo è un diagramma, chiamato "spettro di massa".

Componenti dello Spettrometro di Massa

COMPUTER X Sistema di introduzione DIS GC HPLC PB ESI API A Sorgente ionica EI CI ESI APCI B Analizzatore C Rivelatore EM - FM Magnetico Quadrupolare X - come "introdurre" il campione IT (Ion Trap) ICR (Ion Cyclotron Resonance) TOF (Time of Flight) A - come "produrre" ioni B - come "separare" questi ioni C - come "visualizzare" gli ioni Sistema da vuoto

Analisi di un Campione Incognito

Analizzatore Rivelatore Immaginiamo di avere lo spettro (figura a Introduzione Sorgente ionica dx) dopo aver analizzato un campione incognito, poteva esserci un campione O Ionization O oppure due. Non si può dire se il 105 è un frammento del 136 oppure è uno ione Gas-phase Mass spectrum sample molecules molecolare. Come posso approfondire Fragmentation l'informazione? Come faccio a capire se il 100 105 è un frammento del 136 o ione 77 105 -CO molecolare? Che struttura ha lo ione 105? (0) C+OCH, = I ricercatori pensarono di isolare lo ione 136 80 -HC=CH (·) -OCH, e di rompere lo ione per vedere se il 105 origina dal 136. Unirono due spettrometri: il primo spettrometro genera gli ioni, il primo analizzatore separa lo ione di 40 151 136 (M*) interesse (isola 136) e poi c'è il secondo Relative abundance 8 spettrometro rompe il 136 e il secondo 20 analizzatore separa tutto ciò che si forma. Se vedo che si formano gli ioni 105, 77, 51 0 vuol dire che sono frammenti di 136. Posso 120 20 40 60 80 100 140 m/z fare lo stesso per gli altri ioni, isolo 77 lo rompo e vedo se si forma il 51. In questo modo posso avere informazioni aggiuntive oltre al valore di M/Z per vedere cosa c'è nella struttura dello ione 105.

Principio della Spettrometria di Massa Tandem (MS/MS)

Questo è il principio della tandem mass spectrometry (MS/MS, spettrometria di massa accoppiata), in cui accoppiarono uno spettrometro ad un altro spettrometro.

È un metodo che prevede processi successivi:

• Di isolamento di uno ione precursore
• Di frammentazione dello ione precursore
• Di analisi degli ioni prodotti per frammentazione

Nell'immagine sotto si vede il primo analizzatore che fa passare solo uno ione, all'uscita dell'analizzatore non si mette un rivelatore ma un sistema che rompe lo ione che è stato isolato. Un secondo analizzatore separerà tutto ciò che si è formato.Ione precursore CID (Collison-induced dissociation) Ioni prodotti Isolamento di uno ione -> Frammentazione > Analisi degli ioni Mass-selection Fragmentation Mass analysis Intermediate region Ion source MS-1 MS-2 CID Normal spectrum Mass-selected precursor MS/MS spectrum

MS/MS sta a indicare lo strumento che è in grado di isolare lo ione precursore, frammentarlo, e analizzare tutti gli ioni prodotti per frammentazione. Quindi noi dobbiamo distinguere i risultati del singolo spettrometro (MS) o in tandem (MS/MS), lo spettro di massa MS contiene tutti gli ioni che si sono formati in sorgente mentre lo spettro che si ottiene dopo aver isolato lo ione precursore frammentato lo indico come spettro MS/MS (contiene tutti gli ioni formati dallo ione precursore precedentemente rotto).

Esempio di Spettro MS/MS

Esempio: miscela di peptidi analizzati con sorgente elettrospray e si ottiene uno spettro. Si vede uno ione m/z 881, 1174 e 1762, tutti presenti in sorgente. Ma il primo analizzatore farà passare solo lo ione 1174. Immaginiamo di avere 3 quadrupoli in sequenza: il primo fa uscire solo lo ione 1174, il secondo il 1174 viene frammentato in tanti pezzi, il terzo separa tutti i frammenti che si sono originati dal 1174. Otteniamo uno spettro MS/MS con tutti i frammenti del 1174. In questo spettro MSMS ci sono diverse informazioni, ovveoro tutti i frammenti del 1174.

Product Ion Scan Scelta dello Ione Frammentazione CAD Spettro dei prodotti di Frammentazione Precursore Spettro di massa 1174 100- 888.6 60 +4 881 +2 1762 86.2 201.1 -288 296.8 408.6 = 512.6 - 563.4 -662.4653.3 734.0 - 929.0 0.0 500 1000 1500 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Domanda: come mai se facciamo prima la gascromatografia o HPCL pensiamo di avere nell'analizzatore più analiti contemporaneamente? Perché se la miscela è molto complessa, può essere che la HPLC e gascromatografia non riescano a separarli, quindi sotto un picco c'è la co-eluzione di più molecole.

Spettrometria di Massa Tandem a Triplo Quadrupolo (QqQ)

TANDEM MASS SPECTROMETRY TRIPLO QUADRUPOLO (QqQ) > nello spazio (coppia di analizzatori) Quindi, isoliamo uno ione precursore, lo frammentiamo e registriamo tutti gli ioni formati, ottenendo spettro MSMS. Questo modo di operare si chiama: product ion scan. L'analizzatore fa passare, uno alla volta, tutti gli ioni che si sono formati da ione precursore. Abbiamo diversi spettrometri di massa accoppiati che funzionano come descritto in precedenza. Si ha: una zona nello spazio dove isolo lo ione precursore, una zona dove frammento lo ione e ci metto una cella in modo che collida con il gas e si frammenti, poi c'è una terza zona dove separo tutti gli ioni prodotti.

> Ripete: ho una zona dove c'è il primo analizzatore MS1, isola uno degli ioni formati in sorgente, poi c'è una cella di collisione (collision cell) dove avviene la decomposizione dello ione precursore indotta dalla collisione. La sigla CID è ciò che avviene nella cella: decomposizione indotta da collisione tra ione e gas che inietto. La seconda zona MS2 è la zona dove si separa tutto ciò che si è formato.

759.4 14.4 - 427.4 - 540.2 - 781.8 868.4 4.8 20 19.8 Rel. Int. 2 175.4 - 227.4 - 341.0 435.6 314.4Ci sono diverse tipologie di spettrometri di massa accoppiata. La prima che abbiamo visto è il triplo quadrupolo (QqQ). La prima Q indica che il primo quadrupolo funziona da analizzatore (separa ioni in basse a m/z), il secondo quadrupolo q funge da cella di collisione, il terzo quadrupolo Q funziona da analizzatore (separa ioni formati da decomposizione). Il QqQ è in grado di dare lo spettro MSMS. Ci sono delle ditte costruttrici che fanno il secondo Q curvo per diversi motivi. Non per forza sono tutti e tre uno in fila all'altro.

Collision gas (N2 or Ar) in - + + + + + + + + Quadrupole mass separator Q1 Cutaway view of collision cell Q2 Quadrupole mass separator Q3 Precursor ion (parent ion) Product ions (daughter ions) Selected ion for monitoring Mixture of ions from chromatography column

Spettrometria di Massa Tandem Qq-TOF

TANDEM MASS SPECTROMETRY Qq-TOF (nello spazio)-> la sigla significa: Q primo quadrupolo che separa, secondo q funziona da cella di collisione e il secondo analizzatore è il tempo di volo.

TOF PUSHER DETECTOR RF HEXAPOLES ELECTROSPRAY NEEDLE SKIMMER QUADRUPOLE IN WIDE BANDPASS MODE SAMPLING CONE RIF HEXAPOLE Q -TOF MS MODE

Spettrometria di Massa Tandem TOF-TOF

TANDEM MASS SPECTROMETRY TOF-TOF (nello spazio)-> Indica l'unione dei due tempi di volo. Cosa fa il primo TOF? Separa gli ioni in base m/z, in modo che nella cella di collisione arrivi lo ione di interesse, nella cella si rompe e il secondo TOF li separa in base a m/z. Che cosa avviene all'interno del tubo vuoto del TOF? Lo ione più piccolo è più veloce e quello più grande è più lento. In questa zona lungo il percorso metto un "cancello" in cui passa lo ione più piccolo mentre gli altri sono buttati.

Laser Kollisions- Detektor zelle Subito dopo il cancello metto cella di Evakuiertes Flugrohr collisione per decomporre lo ione e la parte rimanente del tempo di volo separa gli ioni che si sono prodotti. Questo cancello lo apro e chiudo per far passare ione precursore. Alla fine, ho due tempi di volo. Questo Proben- Ionenoptiken Reflektor platte strumento può essere costruito in due modi Source 1 Source 2 diversi: il più diffuso è quello con il cancello (parte alta figura). Ho un pezzo di TOF dove Laser beam First reflector gli ioni si separano e ho un cancello che apro Sample lon trajectory holder e chiudo come voglio, poi si trova cella di Detector collisione e altra parte del TOF che separa. Second reflector Collision cell + + + Detector REFLECTRON

Spettrometria di Massa Tandem a Campo Magnetico

TANDEM MASS SPECTROMETRY CAMPO MAGNETICO (nello spazio)> un magnete genera un campo magnetico su un tubo ricurvo dentro il quale si muovono gli ioni e il tubo permette la deflessione della traiettoria degli ioni separandoli. Posso mettere campo magnetico che seleziona lo ione, una cella di collisione e un secondo campo magnetico (A). Oppure tutti campi magnetici (B). Oppure campo magnetico e campo elettrostatico (C). in realtà questi spettrometri non sono più usati.

C BEB A BE QqQ E B C - Source Detector S 0 -- -- B EBE EBEB BEqQ 0 0 BqQ S S -- S S

Spettri MS/MS con Singolo Analizzatore

Posso ottenere spettri MS/MS anche se ho un singolo analizzatore? Si. Posso operare isolamento, frammentazione e separazione non nello spazio bensì nel tempo. Queste 3 operazioni posso farle avvenire nel tempo: tempo 1 isolo, tempo 2 frammento, tempo 3 separo. Ottengo spettro MS/MS usando un singolo analizzatore. Degli analizzatori descritti prudentemente, quali sono quelli in cui questo percorso può venire dentro l'analizzatore ma in tempi diversi? Nella trappola ionica, perché tutti gli ioni formati in sorgenza restano all'interno della trappola e poi li costringiamo ad uscire e andare verso l'analizzatore in modo da trasformare i pacchetti di ioni in energia. Tutti gli ioni sono dentro la trappola ma posso buttare fuori tutti quelli che non mi interessano e tenere ed isolare lo ione precursore. All'interno della trappola posso fare sì che lo ione collida con un gas messo dall'esterno in modo da decomporsi e infine separare tutto ciò che si è formato per decomposizione dello ione precursore. All'interno della trappola ho un analizzatore, questi 3 fenomeni li posso fare nel tempo.

Analizzatori per Spettri MS/MS nel Tempo

Quali altri analizzatori permettono di ottenere uno spettro MS/MS operando nel tempo? Nel quadrupolo a trappola lineare ci sono Trapping Instruments ioni che si muovono nella trappola. La -Quadrupole lon Trap -Linear lon Trap (LIT) Frammentazione nel TEMPO - isolamento successivo di ioni e loro frammentazione => MS" trappola 3D è quella nella figura grigia e -ICR quella lineare è quella verde e blu. Nella -Orbitrap trappola lineare abbiamo un quadrupolo receiver plate all'entrata e uno all'uscita che tengono gli ioni dentro. Poi c'è un quadrupolo che Q1 Q2 B trattiene gli ioni e li isoliamo buttandoli fuori, 1 trap plate transmitter plate 50% in su e 50% in giù, sono stati posizionati due elettro-moltiplicatori in modo da catturare il 100% degli ioni. Anche nella Q3 trappola lineare, abbiamo introdotto tutti gli ioni, ne isoliamo uno e separiamo gli ioni prodotti. Oppure anche gli analizzatori a MS/MS in time risonanza ciclotronica, dove gli ioni sono dentro l'analizzatore e si può trattenere solo quello di nostro interesse. Questo viene decomposto all'interno dell'analizzatore ICR e separiamo gli ioni prodotti. Anche nell'Orbitrap abbiamo tutti gli ioni che si muovono nell'analizzatore, si fa la stessa cosa, ovvero si buttano via tutti gli ioni trattenendo quello di interesse, si frammenta e si isolano i prodotti.

Z In questo modo abbiamo descritto cosa significa spettro MS/MS, abbiamo descritto i fenomeni che si formano (alcuni spettrometri di massa permettono di avere lo spettro nello spazio o nel tempo).

750 BE E s -D Detector Source