La centrifugazione: tecnica fondamentale per la separazione di componenti biologici

La Centrifugazione in Laboratorio

La centrifugazione è il primo argomento. La centrifuga in laboratorio ormai è quasi un complemento da arredo che tutti utilizzano talvolta senza avere consapevolezza delle sue potenzialità. Spesso la si usa più per esigenze routinarie. In laboratorio si usa soprattutto per separare il siero dai globuli rossi, perché gran parte delle analisi in laboratorio non vengono fatte sul sangue intero ma viene fatta sulla porzione liquida del sangue. Quindi per poter fare delle analisi sul siero o sul plasma (e vedremo anche le differenze che ci sono ed è del richiesto conoscerle all'esame) si lavora sulla porzione liquida. Non sono molte le analisi che vengono fatte su sangue intero: sicuramente la più importante è l'esame emocromocitometrico.

L'esame emocromocitometrico è importante perché mi dà l'informazione sulla componente quantitativa, sulla componente corpuscolata del sangue cioè mi dice quanti globuli rossi ci sono, che forma hanno, che Volume hanno, quanti globuli bianchi ci siano, qual è la loro formula (basofili, neutrofili e così via). Tutte queste informazioni sono estremamente importanti in ambito della valutazione della salute dell'individuo, ed è uno dei pochi esami che si fa su sangue intero, altrimenti tutti gli altri vengono fatti su plasma e siero dopo che viene fatta una centrifugazione, che è il motivo principale per cui viene utilizzato questo macchinario in un laboratorio di analisi.

La centrifugazione è importante anche nel test di Coombs, in cui si fanno diverse procedure laboratoristiche e si pellettano alcune componenti del sangue che vengono separate dalla parte liquida.

In un laboratorio di ricerca, invece, spesso e volentieri la centrifuga può occupare o rivestire un'importanza un po' più allargata.

Principio della Centrifugazione

Cosa fa la centrifugazione?

Alla sospensione, (alla matrice che abbiamo all'interno di una provetta o di un contenitore) viene applicato un campo gravitazionale artificiale, indotto dalla rotazione ad alta velocità, all'interno della centrifuga. Questo campo gravitazionale viene comunemente chiamato campo centrifugo. Viene sfruttata la differenza di densità fra le particelle, che sono all'interno della soluzione, ed il mezzo in cui esse vengono sospese. Per esempio, io posso avere delle proteine, o dei ribosomi all'interno della soluzione (che può essere un tampone fisiologico) e voglio farle in qualche modo precipitare per isolarle dal contesto generale; allora applico questa centrifugazione che fa in modo che la sedimentazione avvenga in tempi più brevi.

In linea generale, le particelle in soluzione se vengono lasciate in condizioni di quiete, quindi non sottoposte alla centrifugazione, tendono a sedimentare per la gravità. Il concetto della sedimentazione lo vediamo spesso applicato. Ad esempio, se prendiamo un'aranciata che è rimasta troppo tempo in frigo notiamo che alla base può essere presente un precipitato, cioè dei componenti di quella soluzione che, sospinti dalla gravità, vengono trascinati verso il fondo. È un processo normale che fa parte della comune fisica in cui viviamo. Il problema sta nel fatto che per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata. La forza gravitazionale per quelle particelle non è così forte da farle precipitare nell'arco di 10 minuti. Anche quando facciamo un prelievo ematico in una Vacutainer (una provetta da 10 cm) e dopodiché la mettiamo in piedi, all'inizio vediamo il sangue intero, cioè una soluzione uniforme. Se riguardiamo dopo un'ora notiamo che nella porzione superiore si sta staccando una parte liquida perché i globuli rossi stanno tendendo alla sedimentazione sospinti dalla forza di gravità. Quindi, anche in condizioni di attesa, semplicemente aspettando 3 o 4 giorni otteniamo una separazione del plasma dall'elemento corpuscolato.

Logicamente se diamo un campo gravitazionale maggiore questo fenomeno avverrà in tempi più brevi ed è quello che cerchiamo di fare in laboratorio perché non abbiamo il tempo di aspettare 3 giorni prima che la soluzione sedimenti, per poter fare l'analisi.

Quindi la centrifugazione non è altro che un processo che avverrebbe normalmente, ma in tempi più rapidi. Infatti, nella maggior parte dei casi il tempo impiegato per la sedimentazione spontanea, se lavoro in laboratorio, potrebbe essere un po' troppo lungo, soprattutto in funzione di alcune particelle. Già i globuli rossi impiegano molto tempo, e sono comunque cellule; se parliamo di elementi ancora più piccoli, come iribosomi, o ancora più piccoli come le singole componenti, cioè le proteine, impiegherebbero anni per sedimentare, o forse anche decenni. Quindi noi acceleriamo questa procedura nel momento in cui ci serve avere quel materiale sedimentato.

L'obiettivo è quello di fare le analisi sul siero. Quindi il paziente fa il prelievo, l'operatore mette la provetta nella centrifuga e in 5 min ho il materiale per fare l'analisi. Questa è una procedura banalissima, fondamentale in un laboratorio di analisi, ma esistono anche altri motivi per fare questo tipo di centrifugazione.

Lo scopo delle tecniche centrifugative è quindi quello di esercitare una forza maggiore nel campo gravitazionale, aumentando così la velocità di sedimentazione. Aumento la forza gravitazionale per aumentare la Velocità.

Nell'immagine in slide vi è riassunto il principio della sedimentazione in cui vi è una sospensione che è omogenea, applico un campo gravitazionale indotto dalla centrifugazione e ottengo le due fasi separate. La fase che ha precipitato normalmente si chiama precipitato o pellet; la parte che rimane su, la frazione liquida, si chiama sopranatante o Surnatante (è preferibile questo termine).

Componenti della Centrifuga

Quindi, ai fini della centrifugazione, le particelle di interesse sono risospese in un adatto solvente e poste nelle opportune provette, le quali vengono alloggiate all'interno di un rotore.

Il rotore è quella componente della centrifuga che ruota per generare il campo centrifugo in cui vengono alloggiate le provette. È posto centralmente rispetto all'albero motore della centrifuga che determina la rotazione. Una volta che applico il campo centrifugo di rotazione, le particelle, che differiscono per densità, per forma, per dimensioni, possono essere fra loro separate perché sedimentano con una Velocità fra loro diversa, che dipende proprio dalla forma, dalle dimensioni e dalla densità. Elementi che invece hanno queste caratteristiche uguali non riusciamo a separarli.

In slide vi è la foto di una piccola centrifuga da banco nella quale sono inserite delle Vacutainer di siero per poterlo separare dai globuli rossi. Queste provette hanno dimensioni di circa 10 cm, ,ma esistono centrifughe anche con rotori e alloggi più piccoli che si usano spesso per centrifugare le provette da 0,5/1/ 1,5 mL , e si chiamano Microfuggi (?) perché lavorano su micro quantità.

Aspetti Tecnici della Centrifugazione

Aspetto tecnico ( che non chiede)

La velocità di sedimentazione di una componente all'interno di una soluzione dipende dal campo centrifugo che io ci applico. Il campo centrifugo, in fisica, è comunemente noto come "G", diretto radialmente verso l'esterno. Quindi quando c'è la rotazione la forza centrifuga è diretta verso l'estero.

Il campo centrifugo è in funzione del quadrato della velocità angolare e raggio. Quindi il campo centrifugo aumenta se faccio girare maggiormente il rotore. Questa relazione è quadratica. Anche il raggio è importante, perché maggiore è la distanza della provetta dal punto di rotazione maggiore è la forza del campo centrifugo che io applico.

Se immaginiamo di scagliare un sasso con una fionda, se la fionda è piccola la forza che riusciamo ad imprimere è bassa, ma se allunghiamo la corda la forza è maggiore perché maggiore è il raggio, a parità di rotazione.

Dunque: se la provetta contenete il campione di interesse è fatta ruotare in circolo, la soluzione è sottoposta ad una forza di gravità artificiale proporzionale alla distanza dal centro di rotazione (raggio) ed al quadrato della velocità di rotazione. Questi sono i due elementi che determinano l'intensità del campo centrifugo applicato.

Se il rotore è fisso e quindi anche il raggio lo è, e voglio aumentare il campo centrifugo applicato devo aumentare la V di rotazione. [2] G= w2r.

La Velocità di rotazione può essere anche espressa in Trad, quindi w può anche essere espresso come : w= 2Ttrev min.60; se sostituiamo nell'equazione precedente otteniamo G=42 (rev min-1)2r3600

Campo Centrifugo Relativo (RCF)

Comunemente, in laboratorio, quello che importa è che facciamo riferimento non a G ma a RCF. Non parliamo mai di campo centrifugo applicato in maniera assoluta.Il campo centrifugo con cui mi interfaccio in laboratorio, in una centrifuga, in realtà è dato da un campo centrifugo relativo: quello che misuro non è un valore assoluto del campo centrifugo, ma quante gravità sto applicando. Quindi è il Campo centrifugo/ la gravità.

RCF= 42(rev min-1)2r3600 x 980

Esprimo il campo centrifugo in numero di volte della gravità.

Se sto centrifugando a 1000 giri vuol dire che lo sto facendo con un campo che è 1000 volte la forza di gravità. Questo è il parametro che si trova nei protocolli, perché è più comodo.

Es di un protocollo: il plasma veniva preparato con un centrifugazione a 2000 G, cioè 2000 volte la forza di gravità.

Calcolo e Conversione RPM

La maggior parte delle centrifughe oggi sono tutte supportate da una componente elettronica molto forte, tanto che già dalla presenza del rotore riconoscono la lunghezza del raggio. Se noi gli diamo un dato G loro la convertono in giri al minuto. Le vecchie centrifughe non erano in grado di fare questo automaticamente, per cui avevo bisogno di una formula di conversione tale che se dovevo andare a 2000 G, dovevo capire in maniera autonoma a quanti RPM corrispondevano nella mia centrifuga. RCF= 1,12r (RPM/1000)2.

RPM= velocità di rotazione giri min-1 ( rev min-1). Ora non è più così.

Si poteva usare anche il nomogramma, che è molto più comodo perché trovo i valori che cerco semplicemente tracciando una linea.

Per es ho gli RCF e il r: a partire dal r traccio una linea retta, passando per il valore di RCF, che poi va avanti e intercetta i valori dell'RPM. Quindi per un raggio di 14 cm, per es, per andare a 1000 G, dovevo impostare la centrifuga a 2700 RPM. Queste metodiche sono storiche, ora non si usano più.

Le nuove centrifughe riconoscono da sole il tipo di rotore e il raggio.

Fattori che Influenzano la Sedimentazione

Dal momento che le analisi biochimiche sono condotte di solito su particelle disciolte sospese in soluzione, la loro velocità di sedimentazione dipende non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche da elementi intrinseci come:

1. Massa della particella, una funzione del suo volume e della sua densità;
2. Densità, cioè dal rapporto che ha la sua massa con il volume che occupa; dalla viscosità del mezzo, importante in particolari tecniche
3. Da quanto la sua forma differisce da quella sferica, perche la forma sferica ha meno attrito rispetto ad una forma piatta che viaggia più lentamente.

Sicuramente il campo centrifugo applicato è l'elemento principale che determina la Velocità, ma questa è influenzata anche da altri fattori intrinseci e sono molto importanti perché sono gli elementi differenziativi delle varie particelle per ottenerne la separazione.

Coefficiente di Sedimentazione

Un altro parametro molto importante è il coefficiente di sedimentazione:

La velocità di sedimentazione di una particella (v) può anche essere espressa in termini di Velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, più comunemente definita coefficiente di sedimentazione, s. v Dico quanto va veloce in funzione dell'unità del campo centrifugo applicato.

s= v/w2r.

Questo significa che a parità di campo centrifugo applicato se una molecola è più veloce avrà un coefficiente s più alto. Quindi il coefficiente s è una caratteristica intrinseca di ogni molecola. Io posso individuare ogni molecola in funzione del suo coefficiente s.

Il valore, solitamente misurato sperimentalmente in condizioni controllate, è una funzione di T, viscosità e densità della soluzione, che io devo tenere standard. Se io tengo costanti questi valori, la velocità per campo applicato è una caratteristica intrinseca di ogni elemento. Ci saranno molecole che viaggiano più velocemente in funzione del fatto che è più densa, ha meno attrito e ha caratteristiche sue.

Per convenzione il coefficiente di sedimentazione è quel valore che si otterrebbe sperimentalmente in acqua a 20℃ e viene riportato come coefficiente di sedimentazione standard S20,w.