PCR Polymerase Chain Reaction: fasi e applicazioni in Biologia

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Poche invenzioni hanno rivoluzionato in maniera così drastica e repentina il corso della biologia molecolare come la PCR. La tecnica è l'approccio per il quale, permettendo l'amplificazione in vitro di frammenti di DNA, da modo di analizzare l'informazione genetica contenuta nel patrimonio genetico di un individuo, con ricadute fondamentali in campi diversissimi, dai laboratori di ricerca pura, ai centri di diagnostica degli ospedali, fino alle aule dei tribunali. L'amplificazione a catena della polimerasi inizia con un numero molto ridotto di copie; infatti, meno coppie ci sono, migliore è l'efficienza della reazione. Quando si amplifica un plasmide, è necessaria una quantità molto piccola di DNA, mentre per un DNA genomico è richiesta una quantità maggiore. Questo è dovuto al fatto che un plasmide purificato contiene solo copie del segmento di interesse, richiedendo quindi poco materiale di partenza. Al contrario, nel caso del DNA genomico, ad esempio per amplificare un gene su un cromosoma sessuale in cellule maschili, abbiamo solo una copia di quel gene nel genoma. Solitamente, si consiglia di utilizzare pochi nanogrammi di DNA: per un plasmide si possono usare circa 5 nanogrammi, mentre per il DNA genomico si raccomandano circa 100 nanogrammi, evidenziando una differenza significativa nelle quantità necessarie. L'attività della polimerasi è quella di aggiungere nucleotidi a partire da un innesco, a partire dall'estremità 51. Per amplificare una determinata sequenza all'interno di un genoma, dobbiamo mettere due inneschi (i primer) che ci fanno capire da dove a dove deve essere amplificata la sequenza.I primer della PCR (Polymerase Chain Reaction) sono brevi sequenze di nucleotidi che servono come punti di inizio per la sintesi del DNA durante il processo di amplificazione. Esistono due tipi di primer:

1. Primer Forward: si lega al filamento di DNA stampo in direzione 5' -> 3' e inizia la sintesi del filamento complementare.
2. Primer Reverse: si lega al filamento di DNA stampo opposto, anch'esso in direzione 5' -> 3', e avvia la sintesi del filamento complementare sull'altro lato.

Entrambi i primer sono specifici per la sequenza di DNA che si desidera amplificare e sono progettati in modo da garantire l'accuratezza dell'amplificazione. Alla fine della PCR, la polimerasi si stacca perché è in grado di sintetizzare solo un certo numero di nucleotidi. Durante il processo di amplificazione, la polimerasi inizia a lavorare dall'estremità 3' del filamento di DNA, ma dopo aver aggiunto una certa quantità di nucleotidi, si ferma a causa della sua limitata processività. La processività si riferisce alla capacità della polimerasi di aggiungere nucleotidi senza staccarsi dal DNA stampo. Diverse polimerasi hanno differenti livelli di processività: alcune possono sintetizzare fino a una kilobase, mentre altre possono arrivare a 20 kilobase o più. A seconda dell'applicazione, come nella PCR in tempo reale, possiamo scegliere polimerasi specifiche che amplificano solo brevi segmenti di DNA, come 200 nucleotidi, per ottenere risultati più precisi.

Fasi della PCR

La prima fase della PCR è la DENATURAZIONE INIZIALE, ovvero la separazione delle due eliche di DNA, facendo diventare il templato single strand. Questa fase avviene tra i 94℃ e i 95℃ per 3-5 minuti. Successivamente entriamo nella fase a cicli. Durante la fase a cicli abbiamo 3 fasi principali:

1. DENATURAZIONE. Avviene a 95°℃ per circa 30 secondi
2. APPAIAMENTO o ANNEALING. Questa fase avviene a una temperatura che dipende dalla sequenza e dalla lunghezza dei primer. È il momento in cui i primer si legano alle loro sequenze complementari nel DNA. Ad esempio, se la temperatura di annealing calcolata è di 60 ℃, il professore imposta la macchina a 62 ℃ per garantire una maggiore specificità. Se si lavora a una temperatura uguale o leggermente inferiore, si corre il rischio di ottenere prodotti aspecifici. Quindi la temperatura di Annealing in generale possiamo definirla come x+2℃, in cui x è la temperatura di annealing calcolata. Questa fase dura 30 secondi
3. EXTENSION. La temperatura in questa fase è di 68℃ o 72℃ in base a che polimerasi si utilizza (c'è scritto sulla scatola della polimerasi solitamente). È la temperatura in cui si ha maggiore efficienza della polimerasi. La durata di questa fase dipende dalla processabilità della polimerasi utilizzata e dalla lunghezza del frammento che si deve amplificare. Ad esempio se la polimerasi amplifica 1000 paia di basi al minuto e il frammento è lungo 500, ci si mette 30 secondi.

Queste 3 fasi si ripetono ciclicamente fino ad un massimo di 35 cicli, perchè dopo i 35 cicli la PCR arriva a plateau. l'ultima fase della PCR è l'EXTENSION FINALE. Avviene alla stessa temperatura dell'extension ma per più tempo (circa 3-5 minuti) per far in modo che si riesca a concludere l'amplificazione dei prodotti che risultavano incompleti Un esempio classico è la costruzione di un vettore per la terapia genica, in particolare per gene addition. In questo caso, inseriamo nelle cellule un costrutto che comprende un promotore, un gene e una sequenza terminatrice. La sequenza terminatrice, di cui esistono diverse varianti, viene incorporata direttamente nei primer per facilitare l'amplificazione del gene. Il tipo di promotore scelto è cruciale; deve essere specifico per il tessuto in cui vogliamo esprimere il gene. Ad esempio, se il gene di interesse è la distrofina, non ha senso utilizzare un promotore attivo nel fegato, poiché la distrofina è rilevante solo nei muscoli. Analogamente, se si tratta di una patologia oculare, non si dovrebbe utilizzare un promotore specifico per il pancreas. I promotori possono variare in lunghezza, tipicamente da una a due chilobasi fino a quelli molto più piccoli. Inoltre, la forza del promotore può influenzare l'espressione del gene, poiché alcuni promotori sono più attivi in determinate cellule.2 fase dei cicli dematurazione iniziale conaturazione annealing extension extension finale 95°℃ x 3-5 min 95°℃ x 30" 68°℃ - 72 ℃ 68°℃ - 72℃ x+ 2℃ x 3-5 min x 30" fino 35 cicli

Reagenti della PCR

Per fare la PCR abbiamo bisogno della provetta da 200 microlitri o meno. La reazione viene svolta in 25-50 microlitri perché il passaggio alle varie temperature può avvenire nel minor tempo possibile. I reagenti che usiamo durante la PCR sono:

1. DNA template: Il campione di DNA da amplificare.
2. Primer: Corti segmenti di DNA che si legano alle sequenze specifiche del DNA target.
3. DNA polimerasi: L'enzima che sintetizza nuovi filamenti di DNA.
4. Nucleotidi: I mattoni (adenina, timina, citosina e guanina) necessari per costruire il nuovo DNA.
5. Buffer: Una soluzione che mantiene il pH e le condizioni ottimali per l'attività della polimerasi.
6. Ioni di magnesio: Essenziali per l'attività della polimerasi, normalmente forniti dal cloruro di magnesio. Entrano nel sito attivo della polimerasi e permettono alla polimerasi di essere più processiva e specifica. Se modifichiamo le concentrazioni di magnesio, cambia il risultato della PCR. Se si aumenta o si diminuiscono le concentrazioni di magnesio la PCR non è così perfetta. La concentrazione ideale di magnesio è 1,5-3 mM.

M 15 2025 30 3.5 40Nella fase di annealing della PCR, si può giocare con la temperatura per ottimizzare il risultato. L'immagine mostra che variando la temperatura tra 50℃ e 60℃, si ottiene una banda di 3 M. 50 52 54 56 58 8 amplificazione. A temperature più basse, oltre alla banda specifica, si osservano anche bande aspecifiche. Aumentando la temperatura di 2℃-3℃ alla volta, si può migliorare la specificità della reazione. Man mano che si alza la temperatura, la banda di interesse diventa più intensa, fino a un certo punto, dopodiché può ricominciare a diminuire. L'obiettivo è trovare la temperatura ottimale in cui si ottiene una banda chiara e specifica per il prodotto desiderato. In un mondo ideale, si potrebbero progettare primer ottimali con la temperatura perfetta e le giuste concentrazioni di magnesio, portando a una PCR estremamente pulita, pronta per essere clonata senza necessità di sequenziamento. Tuttavia, la realtà è diversa: la biologia molecolare presenta sempre margini di errore, poiché utilizziamo enzimi naturali, che possono introdurre mutazioni. Questi errori sono intrinsecamente probabilistici e possono derivare da piccole variazioni nella reazione.

Verifica della PCR

È praticamente inevitabile che, nonostante i nostri sforzi per ottenere risultati ottimali, possano verificarsi mutazioni. Pertanto, cerchiamo di avvicinarci a risultati il più puliti possibile, ma è fondamentale verificare ciò che otteniamo. Questo viene fatto attraverso l'analisi su gel di agarosio, che consente di visualizzare e confermare la presenza dei prodotti amplificati e di identificare eventuali bande indesiderate o aspecifiche. Il gel di agarosio è immerso in un tampone in cui viene applicata una carica elettrica, un campo magnetico, e il DNA, viene messo nel pozzetto insieme a un buffer che contiene glicerolo per far cadere il campione verso il fondo del pozzetto. Una volta applicata la carica elettrica il DNA inizierà a migrare verso il polo positivo.Facciamo un esempio: supponiamo di avere un paziente che non esprime beta-globina. Creiamo un virus che contiene il gene per la beta-globina e infettiamo il paziente. Dopo 48 ore, dobbiamo verificare se il gene della beta-globina è espresso. Per farlo, eseguiamo una PCR e carichiamo il nostro campione, che chiameremo A, su un gel di agarosio. Dopo aver fatto correre il gel per circa 20-30 minuti, osserviamo una banda (nell'esempio vediamo che si trova a 300 nt). Questo indica che il gene della beta-globina è stato amplificato, ma non è sufficiente per confermare la sua presenza. È fondamentale includere un marcatore di peso molecolare. Questo marcatore ci permette di determinare la dimensione della banda amplificata, confrontandola con le bande del marcatore. Anche se abbiamo esperienza su dove dovremmo trovare la banda del nostro gene, il marcatore è 4 necessario per avere una conferma precisa della sua altezza e per verificare che sia correttamente amplificata. (Nell'esempio vediamo che anche il marcatore ha una banda a 300 nt) Se abbiamo amplificato una porzione di DNA e osserviamo una banda che crediamo sia a 800 nucleotidi, possiamo confermarlo seguendo questi passi:

1. Misurazione della Distanza: Utilizziamo un righello per misurare la distanza della banda dal pozzetto. Nell'esempio, supponiamo che la distanza sia di 4,5 cm.
2. Creazione del Grafico: Tracciamo un grafico su carta millimetrata in cui sull'asse X riportiamo il peso molecolare delle bande del marcatore (ad esempio, 100, 200, 300 nucleotidi, ecc.) e sull'asse Y la distanza dal pozzetto delle bande corrispondenti.
3. Interpolazione: Dovrebbe emergere una retta. Una volta tracciato il grafico, possiamo cercare il punto corrispondente a 4,5 cm sull'asse Y. Intersecando questa distanza con la retta del grafico, possiamo determinare il peso molecolare della banda, che in questo caso risulterebbe essere 800 nucleotidi.

M A 1 1 y1 = - 5am - --- 00 00 1000 - ---- 400 - + CONTROLLO POSITIVO E NEGATIVO Successivamente bisogna fare dei controlli: