La Trascrizione del DNA: fasi e regolazione genica in Biologia

L'unità di trascrizione e le tre fasi della trascrizione

LA TRASCRIZIONE L'UNITÀ DI TRASCRIZIONE E LE TRE FASI DELLA TRASCRIZIONE

Tratto di DNA che va dal promotore al terminatore ed è espresso come singola molecola di RNA RNA polimerasi viene a legarsi sul DNA riconoscendo delle sequenze specifiche > PROMOTORE, si trova all'inizio del gene e contiene il nucleotide da cui parte la sintesi dell'RNA. La trascrizione poi procede lungo lo stampo di DNA fino a raggiungere delle sequenze chiamate TERMINATORE definendo in questo modo l'unità di trascrizione.

Unità di trascrizione = tratto di DNA dal promotore al terminatore espresso come una singola molecola di RNA

Sito di inizio Terminatore Promotore XXXXXXXX -35 -10 -1+1 +10 Prossimale Distale Upstream a monte Downstream a valle Figura 9.4 Un'unità di trascrizione è delimitata dal promotore e dal terminatore. Anche nella trascrizione abbiamo polimerasi > enzima che sintetizza RNA su stampo di DNA = RNA POLIMERASI Affinchè RNA polimerasi trascriva molecola DNA ha bisogno di uno stampo e utilizza solo 1 dei filamenti della doppia elica. Anche in questo caso è necessaria creazione BOLLA TRASCRIZIONE, cioè occorre regione DNA che si vada a denaturare. A livello della bolla di trascrizione il filamento di DNA codificante (filamento non usato) e filamento di DNA stampo (usato da RNA polimerasi in modo tale da aggiungere nt complementari), la direzione di sintesi RNA ad opera RNA POLIMERASI è sempre 5'-3' e si sfrutta sempre estremità 3'OH per aggiungere nuovo nucleotide con la base complementare a quella DNA stampo. Questa bolla di trascrizione fornisce all'enzima il filamento stampo e bolla si muove insieme a enzima e DNA si apre via via che enzima procede e si richiude dietro passaggio enzima, in questo processo bolla di trascrizione rimane sempre di una lunghezza costante. Man mano che la trascrizione procede I'RNA trascritto rimane accoppiato solo per un breve tratto per poi staccarsi e al termine RNA verrà dissociato dallo stampo di DNA.

Similitudini e differenze con la replicazione

SIMILITUDINI CON REPLICAZIONE DIFFERENZE RISPETTO REPLICAZIONE

• Sintesi direzione 5'->3'
• Non richiede innesco per avviare sintesi RNA e interessa solo specifici tratti del DNA e non tutta la molecola
• Ha bisogno filamento stampo
• In ciascun evento di trascrizione uno dei due filamenti funge da stampo
• Presenta fase di inizio, una di allungamento e una di terminazione
• RNA prodotto non rimane accoppiato alle basi dello stampo di DNA

Tra l'altro filamento stampo può essere sia 3'-5' che 5'-3', RNA polimerasi si lega al promotore con un orientamento prefissato, se filamento stampo è con direzionalità 5'-3' RNA polimerasi si muove sempre sintetizzando RNA in direzione 5'-3', se filamento stampo è nella direzione 3'-5' RNA polimerasi si orienta/ posiziona sul promotore in modo opposto; RNA sempre sintetizzato in direzione 5'-3' ma lo stampo è quello 3'-5'. In una bolla di trascrizione RNA polimerasi ha preferenza per ciascun promotore per uno dei due filamenti stampo e viene usato come stampo sempre lo stesso filamento DNA > RNA polimerasi si orienterà in modo tale da utilizzare o un filamento oppure l'altro ma, per ciascun promotore,

Gene 1 Gene 2 Gene 3 ho fisso l'utilizzo di quello 3' A 5' 3' V 5' 3 specifico filamento stampo. 5 · L'RNA polimerasi si lega al promotore con un orientamento prefissato, così dallo stesso promotore viene sempre trascritto lo stesso filamento di DNA. 5' 3 5 Filamento stampo . Quindi l'orientamento dell'RNA polimerasi su quel tratto di DNA, determinerà quale dei due filamenti del DNA fungerà da stampo. (a) Filamento stampo del gene 2 RNA Svolgimento 3' Riavvolgimento 5' 5'100 3º UAC G GAUG CA ATGCCTACGT 5' RNA polimerasi Filamento stampo del gene 1 RNA Filamento non-stampo del gene 2 RNA polimerasi Gene 1 Gene 2 AGCCCATA GAUCGGGUATO c DNALo stampo di DNA per la sintesi di RNA

Convenzioni per la scrittura delle sequenze

Per convenzione il gene, il promotore e le sequenze di regolazione del DNA si scrivono come appaiono sul filamento codificante ricordando che il filamento codificante o DNA non-stampo risulta avere la stessa sequenza dell'RNA trascritto, mentre la sequenza del DNA stampo è complementare all'RNA trascritto e al filamento codificante > quindi in base a filamento codificante possiamo dedurre la sequenza RNA, che sarà praticamente identica, e quella del DNA stampo, che sarà complementare a filamento codificante e all'RNA.

Codone di inizio DNA codificante GACGTTAAATATAAACCTGAAGATTAAACATGACTGAATCTTTTGCTCAACTCTTTGAAGAGTCCTTAAAAGAAATCGA DNA stampo CTGCAATTTATATTTGGACTTCTAATTTGTACTGACTTAGAAAACGAGTTGAGAAACTTCTCAGGAATTTTCTTTAGCT RNA GACGUUAAAUAUAAACCUGAAGAUUAAACAUGACUGAAUCUUUUGCUCAACUCUUUGAAGAGUCCUUAAAAGAAAUCGA

Per convenzione, il gene, il promotore e le sequenze di regolazione del DNA si scrivono come appaiono sul filamento codificante

DNA (NON STAMPO) CODIFICANTE DNA STAMPO RNA TRASCRITTO

5'-CGC TAT GCG GTT T-3' 3'-GCG ATA CGC CAA A-5' 5'-CGC UAU GCG GUU U-3'

Accoppiamento trascrizione/traduzione nei procarioti

Accoppiamento trascrizione/traduzione nei procarioti RNA che viene trascritto durante sintesi RNA stesso, non rimane appaiato per tutta la lunghezza della trascrizione al DNA stampo per poi dissociarsi completamente al termine della trascrizione. Durante la trascrizione abbiamo che la disponibilità di questo mRNA di lunghezza sufficiente per posizionare i ribosomi, la traduzione inizia immediatamente. Quindi nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono praticamente in contemporanea > mentre si allunga mRNA durante sintesi, si ha che questo viene contemporaneamente tradotto in proteine. Negli eucarioti questo non è possibile perché mRNA messaggero negli eucarioti non è immediatamente pronto per la traduzione ma deve subire processo MATURAZIONE > quando trascritto è maturo viene traslocato dal nucleo al citoplasma dove avverrà traduzione.

Fasi della trascrizione nei procarioti e eucarioti

FASI TRASCRIZIONE PROCARIOTI ED EUCARIOTI

1. Inizio della trascrizione

1. INIZIO a. Promotore deve essere riconosciuto da RNA polimerasi, quindi si lega a promotore senza denaturare immediatamente DNA ne formare bolla ma creando un legame chiamato COMPLESSO CHIUSO b. Una volta che RNA-pol si è stabilmente legata a promotore si ha serie di cambiamenti di conformazione a interno polimerasi che promuovono apertura bolla di trascrizione e quindi formazione del COMPLESSO APERTO che coinvolge parte finale del promotore, incluso il sito d'inizio e RNA polimerasi le sequenze a valle del sito d'inizio. > FASE DI MELTING DEL PROMOTORE proprio perché c'è DNA a monte ++1 apertura doppia elica c. RNA-pol inizia a sintetizzare RNA -> all'inizio sintetizza RNA senza distaccarsi dal promotore e inizia a fare serie di tentativi di sintetizzare RNA sufficientemente lungo che ibridizza co DNA stampo e deve essere un ibrido stabile > INIZIO ABORTIVO cioè RNA-pol non parte subito a sintetizzare RNA a gran velocità ma sintetizza frammenti RNA finchè non produce un RNA di 10bp che è sufficiente per creare ibrido stabile DNA-RNA e a questo punto inizia la sintesi. Questo inizio abortivo avviene perché RNA-pol non usa primer, una giunzione innesco-stampo per partire con sintesi RNA e quindi è lei che sintetizza immediatamente RNA con una serie di tentativi iniziali. DNA a valle promotore legame (complesso chiuso) inizio "apertura" (melting) del promotore (complesso aperto) bolla di trascrizione di 13 bp inizio della trascrizione [ RNA RNA di 10 bp I

2. Allungamento della trascrizione

1. ALLUNGAMENTO RNA-pol abbandona promotore e inizia ad allungare RNA; durante fase allungamento enzima si muove inmodo da sintetizzare sempre in direzione 5' -> 3' RNA e mentre si sposta lungo DNA, muove con se anche bolla di replicazione. DNA si apre nella direzione della sintesi e si richiude alle sue spalle, in modo tale da mantenere bolla di una lunghezza costante RNA-pol in questa fase ha diverse funzioni: a. Sintetizza RNA b. Separa i due filamenti di DNA a valle e li riavvolge a monte dell'enzima c. Stacca la catena RNA dallo stampo di DNA d. Funziona da correttore di bozze L'azione di apertura della doppia elica per creare la bolla viene a generare a valle RNA-pol dei superavvolgimenti positivi e per evitare che la trascrizione si blocchi dovranno intervenire le topoisomerasi a risolverli. RNA terminazione la polimerasi termina e rilascia I'RNA

3. Terminazione della trascrizione

1. TERMINAZIONE: allungamento RNA-pol rilascia RNA prodotto, si dissocia da DNA e nei batteri esistono delle sequenze specifiche alla fine del gene che sono appunto i TERMINATORI che consentono proprio questa dissociazione della polimerasi.

Le RNA polimerasi

LE RNA POLIMERASI I batteri hanno 1 sola RNA polimerasi, RNAP core, mentre le cellule eucariotiche 3 RNAP I, RNAP II, RNAP III.

• RNA pol I si occupa sintesi rRNAs
• RNA pol II si occupa della sintesi mRNAs, microRNA
• RNA pol III si occupa della sintesi di tRNAs, rRNA 5s

Ma recentemente sono state identificate altre 2 RNA polimerasi, che utilizzano sempre il DNA come stampo, che sono RNA pol IV e RNA pol V. Nella RNA pol batterica, la componente enzimatica è RNAP core ed è costituita da una serie di subunità:

• 2 subunità beta
• 2 subunità alfa
• 1 subunità omega

Per ciascuna di queste unità negli eucarioti vi è la corrispondente componente proteica, il core enzimatico è il P core ma quando questo core si associa un altro fattore, detto fattore sigma, si parla di oloenzima della RNA polimerasi batterica; è un oloenzima con una struttura più semplice rispetto a DNA pol batterica, però anche in questo caso una componente proteica aggiuntiva supporta l'attività enzimatica dell'RNA P core. La struttura della RNA pol viene indicata con una figura che ricorda una chela di granchio in cui le pinze corrispondono alle subunità beta e beta'. Il sito attivo la sintesi e l'aggiunta dei ribonucleotidi si trova alla base delle 2 pinze tra le 2 subunità beta e beta'. Questa regione dove si trova sito attivo si chiama solco centrale attivo.

Meccanismo della sintesi di RNA

Meccanismo della sintesi di RNA Reazione di polimerizzazione è analoga a quella DNA polimerasi, RNA sintetizza il filamento in direzione 5'->3' e anche per RNA pol estremità 3'OH libero del filamento di RNA nascente va a colpire fosfato alfa del nuovo ribonucleotide. La reazione prevede rilascio pirofosfato con addizione nuovo ribonucleotide a catena RNA. Anche qui enzima presenta nel sito attivo 2 ioni Mg++ che consentono di ridurre affinità H per O2 in posizione 3' in modo da creare ossigeno carico negativamente che va a colpire fosfato alfa rilasciando pirofosfato. Unica differenza rispetto DNA pol è che si ha utilizzo di un unico filamento stampo e che sta sintetizzando un RNA, quindi, entrano nel sito attivo dei ribonucleotidi e non dei deossiribonucleotidi.

Canali della RNA polimerasi

Canali RNA polimerasi RNA pol ha diversi canali che consentono passaggio DNA, RNA e ribonucleotidi verso e dal solco centrale. A livello del solco centrale ci sono diversi canali:

• Primo canale permette ingresso DNA che deve essere denaturato e trascritto
• Canale consente ingresso ribonucleotidi
• Canale da cui esce RNA neosintetizzato

RNA pol ha sorta perno che consente separazione dei due filamenti rendendo disponibile filamento stampo.

RNA polimerasi Canale di uscita del DNA Filamento codificante 3 Canale di ingresso del DNA 5 3' 3 Canale di ingresso degli rNTP RNA 5' Canale di uscita dell'RNA Direzione della trascrizione allungamento