Necroptosi, ferroptosi e P53: meccanismi e implicazioni patologiche

Necroptosi: Morte Cellulare Programmata

BERNASSOLA lezione 8 del 14/01/2025 La necroptosi è una forma di morte cellulare programmata che ha un decorso molecolare diverso dall'apoptosi ma soprattutto è una morte litica ossia si formano dei pori sulla membrana plasmatica che facilitano quindi l'ingresso di acqua e di ioni che determinano un cambiamento dell'osmosi e quindi porta alla morte cellulare.

Dell'apoptosi abbiamo detto che è importante dal punto di vista fisiologico e una delle applicazioni più importanti è nell'embriogenesi, avevamo fatto l'esempio della perdita dei neuroni durante lo sviluppo del sistema nervoso che avviene per apoptosi. Oppure l'eliminazione della membrana (?) durante lo sviluppo degli anfibi.

Ruolo della Necroptosi nello Sviluppo Embrionale

La necroptosi non è un evento fisiologico, sono noti pochissimi esempi di contesti in cui interviene, ora vediamo 2 esempi in cui avviene la necroptosi al posto dell'apoptosi durante lo sviluppo embrionale dei mammiferi: durante lo sviluppo embrionale di C. elegans, hanno identificato un ruolo della necroptosi nell'eliminazione delle cellule linker che aiutano a determinare la morfologia delle gonadi maschili del verme e muoiono per necroptosi. L'altro esempio è durante l'embriogenesi del pollo i neuroni motori del midollo spinale muoiono per necroptosi. In generale, la necroptosi non ha un ruolo fisiologico, a meno che non si presentino condizioni in cui le caspasi sono assenti o difettive.

Esistono solo questi due esempi poiche è noto che la necroptosi non interviene nei processi fisiologici ma patologici. Quindi questa morte litica è una morte immunogenica perché interviene in processi patologici interessati da infiammazione.

Studi sul Fenotipo degli Anticorpi Knock-out per la Necroptosi

A riprova che la necroptosi è una morte che non interviene nei processi fisiologici, quando hanno studiato il fenotipo degli anticorpi Knock-out per tutte e tre le proteine chiave della necroptosi: RIPK1, RIPK3, MLKL (proteina effettrice), questi topi non presentano un fenotipo evidente. Hanno potuto trovare un coinvolgimento della necroptosi solamente quando hanno iniziato a incrociare questi topi per RIPK1 con topi che avevano sviluppato dei quadri infiammatori, per esempio hanno incrociato il Knock-out per RPK1 con un topo con il Knock-out per il gene che si chiama shartoon (?) che è un gene coinvolto nell'infiammazione per cui questi due topi avevano un quadro infiammatorio a carico di diversi organi come la cute. Quando lo incrociavano con il topo con il Knock-out per RPK1 vedevano che la patologia infiammatoria in qualche modo veniva reverita.

Necroptosi e Propagazione dei Virus Intracellulari

Infine, la necroptosi è stata implicata nel contesto per la propagazione dei virus intracellulari, quando abbiamo parlato dell'apoptosi, uno degli aspetti patologici dell'apoptosi è la propagazione del virus poiché esso mette in atto delle strategie per inattivare la capacità della cellula infettata di andare incontro al suicidio per apoptosi in maniera di potersi replicare. Quindi andavano a traghettare diverse molecole, tra cui le caspasi e ci sono alcuni virus che sono in grado di inibire la caspasi 8. Però così facendo, poiché l'inibizione della caspasi 8 è una prerogativa per il passaggio dall'apoptosi alla necrosi, perchè solo nel momento in cui manca la caspasi 8 le cellule cambiano strategia e usano l'apoptosi per morire, questi virus tolgono la caspasi 8 ma utilizzano la necroptosi come meccanismo di riserva per andare incontro a morte ed eliminare il virus. Nell'immagine ci sono elencate alcune condizioni infiammatorie associate alla necroptosi con accanto le alterazioni che sono state osservate. Per esempio, nella sclerosi multipla è stato osservato un aumento dei livelli delle due chinasi. Nel danno da riperfusione ischemica ne avevamo parlato anche per l'apoptosi poiché questa è la prima forma di morte che viene innescata a livello del miocardio però quando si evolve la seconda onda che è la conseguenza della riperfusione con aumento deineutrofili, aumentano nuovamente i livelli di ROS, la morte cellulare cambia da apoptotica ad altre forme infiammatorie poiché nel danno da riperfusione ischemica c'è anche una condizione infiammatoria. Quindi soprattutto nella seconda fase che è la riperfusione rientra in gioco la necroptosi. In questo caso le alterazioni osservate sono livelli aumentati di TNF e ligando FAS ma è evidente che per fare uno switch tra l'apoptosi e la necrosi ci deve essere: Inattivazione della caspasi 8 ma anche un aumento dei recettori di morte.

Malattie e Alterazioni Associate alla Necroptosi

La Ferroptosi: Una Forma di Necrosi Regolata

LA FERROPTOSI Rappresenta una forma di necrosi regolata innescata dal collasso di uno specifico sistema di difesa antiossidante. Sembra essersi evoluta separatamente e più anticamente delle altre forme di morte cellulare programmata.

Caratteristiche della Ferroptosi

• E' una forma di morte da stress ossidativo, causata da un accumulo di perossidi lipidici (acidi grassi poli-insaturi dei fosfolipidi di membrana) che precede la morte della cellula. Derivano in parte dalla perossidazione spontanea che avviene in presenza di radicali idrossilici (OH·) generati dalla reazione di Fenton tra Fe+2 e H2O2.
• Richiede attivazione del metabolismo del ferro per la sua esecuzione e l'inibizione del meccanismo di importo intracellulare della cistina. E' il risultato di un'alterazione dell'equilibrio tra accumulo di perossidi lipidici e diminuzione delle difese anti-ossidanti cellulari, causato da diversi fattori che inattivano la glutatione perossidasi.
• Aspetti morfologici e biochimici distinti dalle altre forme di morte cellulare programmata. Il volume e la condensazione del nucleo non cambia, i mitocondri sono atrofici (aumento della densità della membrana e diminuzione delle creste mitocondriali), perdita dell'integrità della membrana.
• Non è associata ad attivazione delle caspasi.

Meccanismo della Ferroptosi

A questo punto parliamo di un'altra forma di morte programmata che è la ferroptosi che inseriamo in questo contesto poiché è regolata da un punto di vista biochimico ma che differisce per molti aspetti dalle altre forme di morte. Differisce per prima cosa per il meccanismo > non c'è il coinvolgimento né diretto né indiretto delle caspasi, il fattore critico nell'induzione della ferroptosi è lo stabilirsi del disequilibrio tra la perossidazione dei lipidi della membrana plasmatica causata da un accumulo eccessivo delle specie reattive all'ossigeno e la capacità della cellula di rispondere con le adeguate difese antiossidanti. Quindi nel momento in cui normalmente i ROS vengono prodotti e normalmente esistono delle difese antiossidanti, quando questo equilibrio si altera le cellule vanno incontro a ferroptosi.

Quindi la ferroptosi è una morte cellulare causata da un eccessivo e non bilanciato contenuto di ROS che hanno come target tutte le macromolecole come proteine, acidi nucleici, ma in questo caso reagiscono con i fosfolipidi, vanno a creare un danno sulla membrana plasmatica che all'aggravarsi porta a una perdita dell'integrità di questa. Quindi anche in questo caso è una morte cellulare litica in cui la cellula muore in modo simile a quando vanno incontro a necrosi e muore per perdita dell'integrità della membrana, di conseguenza è una morte immunogenica e infiammatoria.

Morfologia e Distinzione della Ferroptosi

Quindi il meccanismo è diverso, la morfologia è diversa, le cellule che muoiono per ferroptosi non hanno dei caratteri e una morfologia rilevabile con il microscopio ottico, al microscopio elettronico si può notare l'assenza di frammentazione del nucleo a differenza dell'apoptosi e assenza della condensazione della cromatina. Le cellule diventano più piccole ma non c'è un evidente condensazione del citoplasma, c'è un cambiamento a livello dei mitocondri che presentano atrofia (le membrane dei mitocondri aumentano di densità e c'è una diminuzione delle creste mitocondriali). Non è facile distinguere le cellule che vanno incontro a ferroptosi.Inoltre non è associata ad attivazione delle caspasi. È una forma di morte che dal punto di vista evolutivo è molto più antica delle altre tanto che è stata ritrovata in cellule filologicamente molto distanti dai mammiferi (protozoi e funghi).

Ruolo del Metabolismo del Ferro nella Ferroptosi

Infine, un forte contributo di questa morte cellulare deriva dal metabolismo del ferro perché il ferro in quantità eccessive se non correttamente immagazzinato all'interno delle cellule va incontro a quella che si chiama la reazione in Fenton che è una reazione in cui il ferro allo stato di ossidazione +2 (stato ridotto) cede l'elettrone all'acqua producendo il radicale ossidrilico (OH). Quindi questa reazione e non solo, rappresenta una delle principali fonti di ROS.

La ferroptosi è il risultato del disequilibrio che si crea a causa di una produzione di ROS e l'incapacità della cellula di reagire per capire meglio questi meccanismi, è importante vedere il metabolismo del ferro verso le difese antiossidanti. Mentre per l'apoptosi se alla cellula vengono date le reazioni ionizzanti, questa muore, in questo caso qualsiasi componente che regola la ferroptosi può contribuire. Quindi andiamo a vedere le componenti importanti, il primo di tutti è sicuramente il ferro.

Il Metabolismo del Ferro

Il metabolismo del ferro Questo viene regolato a diversi livelli: nel trasporto epatico, nel suo importo cellulare, £ nel suo immagazzinamento nella cellula e anche a livello del suo esporto (in relazione al contenuto di ferro intracellulare è importante anche trasportato al di fuori).

Fe2 Hepcidin Fe2+ DMT1 Intracellular space TFR1 IRP1/2 TFR1 ZIP8/14 PHD2 FIH1 DOHH Fe3+ Fe2. Ferritin STEAP3 DMT1 PCBP1/2 FeFe3+ Metallation FIL Late Endosome LIP Fenton Reaction Il ferro Fe+2 è un reagente redox-attivo che promuove la produzione di ROS attraverso la reazione di Fenton.

ROS transferrina che è una proteina che può legare fino a 34 mila (?) atomi di ferro

• Affinché questo venga importato a livello della cellula la transferrina lega il recettore TFR1
• A questo punto l'ingresso del ferro avviene per endocitosi > si forma una vescola che viene importata all'interno del citoplasma e il ferro si trova allo stato di ossidazione +3 quindi la transferrina lo porta allo stato di ossidazione +3 all'interno dell'endosoma. A causa di un pH acido la proteina STEAP3 (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate) che è una metallo reduttasi riduce il ferro da +3 a ferro +2 (che è lo stato post riduttivo prono a fare la reazione di Fenton e a produrre radicali)
• Questo ferro +2 non può rimanere libero nel citoplasma; pertanto, prevalentemente viene immagazzinato grazie alla proteina responsabile dell'immagazzinamento che è la ferritina che prende il ferro +2 e lo trasforma in ferro +3
• Il ferro +2 che è nel citoplasma se in eccesso può andare incontro alla reazione di Fenton e quindi contribuire alla ferroptosi
• Un'altra proteina importante che serve a esportare il ferro è la ferroportina (FPN) -> prende il ferro +2 e lo ritrasforma in ferro +3 e lo rilascia nello spazio extracellulare.

Le proteine importanti nel metabolismo del ferro sono: la transferrina che lo trasporta, il recettore TFR1 della transferrina, la ferritina che lo immagazzina, la ferroportina che lo porta all'esterno.

Step del Trasporto del Ferro

Gli step importanti sono:

• ferro viene trasportato nel circolo ematico dalla TF + Fe3+ AFPN