Dal DNA all'ingegneria genetica: biologia molecolare e tecniche di sequenziamento

I nucleolidi e gli acidi nucleici

La struttura dei nucleotidi

I nucleotidi sono le unità base che formano gli acidi nucleici, che sono grandi molecole fondamentali per conservare, trasmettere e usare le informazioni ereditarie. Ogni nucleotide è fatto da tre elementi: uno zucchero, un gruppo fosfato e una base azotata. Il gruppo fosfato, che ha un atomo di fosforo al centro, rende la molecola acida.

Lo zucchero presente nei nucleotidi è un tipo particolare con cinque atomi di carbonio. Nel DNA si chiama desossiribosio, mentre nell'RNA si chiama ribosio. Le basi azotate sono formate da uno o due anelli composti da atomi di carbonio e azoto. Ce ne sono cinque e si dividono in due gruppi: le pirimidine, che hanno un solo anello e sono la citosina, la timina e l'uracile, e le purine, che hanno due anelli e sono l'adenina e la guanina.

Per creare un nucleoside, lo zucchero si unisce a una base azotata. Questo legame avviene tra il gruppo -OH dello zucchero (nel carbonio 1') e il gruppo amminico della base (in posizione 1 per le pirimidine o in posizione 9 per le purine), e durante questa reazione si perde una molecola d'acqua. Quando al nucleoside si aggiunge un gruppo fosfato, si forma un nucleotide, anche in questo caso con eliminazione di una molecola d'acqua.

Quindi, i nucleotidi sono composti da una base azotata, uno zucchero e un gruppo fosfato. Il nome del nucleotide è dato dal nome del nucleoside seguito dalla parola "monofosfato". La sigla usata per indicare i nucleotidi ha tre lettere: la prima è la lettera iniziale della base (A, C, G, T, U), la seconda indica che c'è un solo fosfato (M per mono), e la terza rappresenta il gruppo fosfato (P). Se lo zucchero è il desossiribosio, si parla di desossinucleotidi, e il loro nome ha davanti la lettera "d".

Gli acidi nucleici

I nucleotidi si possono unire tra loro: il gruppo fosfato di uno si lega al gruppo -OH del carbonio 3' dello zucchero del successivo. Questo tipo di legame si chiama legame fosfodiestere. Quando molti nucleotidi si legano così, si forma una lunga catena chiamata polinucleotide.

Ogni polinucleotide ha due estremità: una con un gruppo fosfato libero sul carbonio 5' (estremità 5') e una con un gruppo -OH libero sul carbonio 3' (estremità 3'). Ci sono due tipi principali di acidi nucleici. II DNA è formato da desossiribosio e da quattro basi: adenina, guanina, citosina e timina. Contiene tutte le informazioni genetiche e si trova nel nucleo della cellula. L'RNA invece contiene ribosio e le sue basi sono adenina, guanina, citosina e uracile. L'RNA esiste in vari tipi. Alcuni, come I'RNA messaggero, lavorano nel citoplasma e servono a tradurre le istruzioni del DNA in proteine. Altri tipi di RNA restano nel nucleo e aiutano a regolare vari meccanismi.

La struttura secondaria del DNA

II DNA ha una forma a doppia elica, cioè due fili che si avvolgono uno intorno all'altro. I due filamenti vanno in direzioni opposte: uno va dal 3' al 5', l'altro dal 5' al 3'. Le basi azotate dei due filamenti stanno all'interno della doppia elica e sono una sopra l'altra, mentre lo zucchero e il gruppo fosfato stanno all'esterno.

La forma più comune del DNA è detta DNA-B, ha una spirale che gira verso destra, un diametro di circa 2 nanometri, e 10 coppie di basi per ogni giro della spirale. La struttura presenta due solchi: uno maggiore, che è più largo e profondo, e uno minore, che è più stretto e poco profondo.

La stabilità della doppia elica è data da vari tipi di legami, tra cui i legami a idrogeno tra le basi che si trovano una di fronte all'altra. Le basi si legano solo con altre specifiche: una purina può legarsi solo con una pirimidina. Questo legame preciso fa sì che i due filamenti siano complementari, cioè conoscendo uno si può sapere la sequenza dell'altro.

La replicazione del DNA

Il DNA può essere copiato in modo preciso grazie al fatto che i due filamenti sono complementari. Questo processo si chiama replicazione e serve per creare due copie identiche della molecola originale. La replicazione è un tipo di reazione in cui si costruisce una nuova catena di DNA usando come modello il filamento già esistente.

Durante la replicazione, il DNA si apre solo in alcuni punti, in modo che i due filamenti si separino per brevi tratti. L'apertura inizia da zone precise chiamate origini di replicazione. Queste zone sono ricche di basi A e T, che sono più facili da separare rispetto alle G e C, perché hanno solo due legami a idrogeno invece di tre.

La separazione dei filamenti viene fatta da un enzima chiamato elicasi, che rompe i legami tra le basi e allarga la bolla di replicazione, cioè la zona dove i filamenti sono separati. Da lì si formano due forcelle replicative che avanzano in direzioni opposte. Ma siccome i filamenti sono attorcigliati tra loro, un altro enzima, chiamato topoisomerasi, si occupa di togliere questi intrecci per permettere la separazione.A questo punto interviene la primasi, un enzima che costruisce un piccolo pezzo di RNA chiamato primer. Questo primer serve per far iniziare la costruzione del nuovo filamento di DNA da parte della DNA polimerasi. Questo enzima può lavorare solo aggiungendo nucleotidi in una direzione, dalla posizione 5' a quella 3'. Questo significa che i due filamenti vengono copiati in modo diverso. Il filamento che viene letto in direzione 3' -> 5' viene copiato senza interruzioni, ed è chiamato filamento continuo o veloce. L'altro filamento, invece, che va da 5' a 3', non può essere copiato tutto insieme, ma solo a piccoli pezzi chiamati frammenti di Okazaki, man mano che la forcella di replicazione si apre. Questo filamento è detto filamento discontinuo o lento.

Una volta che questi frammenti sono stati costruiti, entrano in gioco altri enzimi. Le RNasi eliminano i primer di RNA, lasciando dei buchi. Questi buchi vengono riempiti dalla DNA polimerasi, e poi un altro enzima, la DNA ligasi, unisce tutti i pezzi per creare un unico filamento continuo.

La trascrizione del DNA

Il DNA contiene le informazioni per costruire le proteine, ma non le produce direttamente. Per farlo, usa delle copie chiamate RNA. Ogni pezzo di DNA che contiene istruzioni si chiama gene, e viene copiato in RNA grazie a un processo chiamato trascrizione.

La trascrizione è fatta da un enzima chiamato RNA polimerasi, che costruisce una nuova molecola di RNA partendo da un solo filamento del DNA, chiamato filamento stampo. L'altro filamento non viene copiato. Anche qui, il nuovo RNA sarà complementare e opposto al DNA che viene letto.

La trascrizione avviene in tre fasi:

L'inizio avviene quando l'RNA polimerasi si attacca a una sequenza specifica del DNA chiamata promotore. II promotore indica all'enzima da dove deve partire. Nei batteri c'è un solo tipo di RNA polimerasi, mentre nelle cellule eucariote ce ne sono tre, ognuna specializzata per tipi diversi di geni.

Durante l'allungamento, I'RNA polimerasi apre il DNA in un piccolo tratto di circa 12-14 coppie di basi, chiamato bolla trascrizionale, e inizia a leggere il filamento stampo in direzione 3' -> 5'. L'enzima aggiunge i nucleotidi all'estremità 3' dell'RNA che si sta formando, quindi il nuovo RNA cresce nella direzione 5' -> 3'. A differenza del DNA, per iniziare la trascrizione non serve un primer.

Alla fine, si arriva alla terminazione, cioè quando l'RNA polimerasi incontra una sequenza specifica che le dice di fermarsi. A quel punto, I'RNA appena formato viene rilasciato.

Alla fine della trascrizione, si ottengono vari tipi di RNA. Solo una piccola parte, circa il 4%, verrà poi usata per costruire proteine (sono gli RNA codificanti). Tutti gli altri RNA (non codificanti) non producono proteine, ma hanno ruoli importanti nella cellula, per esempio aiutando altri RNA o formando strutture come i ribosomi.

La genetica dei virus

Le caratteristiche dei virus

I virus sono organismi piccolissimi che per vivere e riprodursi devono entrare dentro una cellula. Da soli non sono capaci di fare nulla: devono sfruttare tutto quello che ha la cellula per poter creare nuove copie di sé stessi. Per questo motivo si chiamano parassiti endocellulari obbligati.

Ogni virus è fatto principalmente da tre parti:

• Il genoma virale, che può essere formato da DNA o RNA, con uno o due filamenti.
• Il capside, che è una specie di guscio fatto di proteine che protegge il materiale genetico del virus.
• Alcuni virus hanno anche un rivestimento esterno, chiamato pericapside o envelope, fatto di lipidi.

Per creare nuove copie, il virus deve entrare in una cellula, prendere il controllo dei suoi meccanismi e farla lavorare solo per produrre nuovi virus. Questo processo si chiama ciclo vitale del virus.

Il ciclo litico e lisogeno dei batteriofagi

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano i batteri. Questi virus possono seguire due strade diverse: il ciclo liticooppure il ciclo lisogeno.

• Nel ciclo litico, il virus entra nella cellula del batterio, produce tanti nuovi virus, e poi la cellula scoppia, liberando i virus che andranno a infettare altre cellule.
• Nel ciclo lisogeno, il virus non distrugge subito la cellula. Invece, si "nasconde" dentro il DNA del batterio. In questo stato, chiamato latenza, il virus non si replica subito. Il suo DNA, che si chiama profago, viene copiato ogni volta che il batterio si divide. In questo modo il virus resta dentro tante nuove cellule senza fare danni per un po'.

Il virus può passare dal ciclo lisogeno a quello litico quando la cellula è in difficoltà o sotto stress. In quel momento, il profago si stacca dal DNA del batterio e comincia a creare nuovi virus, facendo scoppiare la cellula.Il virus riesce a decidere quale ciclo seguire grazie a due proteine: cI e Cro. La proteina cI mantiene il virus nella fase lisogena, mentre Cro lo spinge a entrare nella fase litica. Queste due proteine agiscono su promotori diversi del DNA del virus, attivando o spegnendo i geni a seconda del ciclo scelto.

I virus animali a DNA

I virus a DNA che infettano cellule animali possono avere un DNA a singolo o doppio filamento e possono seguire sia un ciclo litico sia un ciclo lisogeno. Nel ciclo lisogeno, il DNA virale si integra nel DNA della cellula e forma un provirus. Il virus resta lì in silenzio e non provoca sintomi, ma ogni volta che la cellula si divide, anche il provirus viene copiato.

Questi virus entrano nella cellula in due modi:

• Per fusione, cioè unendosi alla membrana della cellula.
• Per endocitosi, cioè quando la cellula li ingloba.

Una volta dentro, il DNA virale si libera e comincia a usare la cellula per riprodursi.

Un esempio importante è quello dei papillomavirus umani (HPV). Questi virus non hanno il pericapside e il loro DNA è a doppio filamento, protetto da un capside a forma icosaedrica. Esistono più di cento tipi di HPV: la maggior parte causa semplici verruche sulla pelle o sulle mucose, ma una quarantina di questi colpiscono le mucose genitali e alcuni possono causare tumori. Il virus entra nel corpo attraverso piccole ferite nella pelle o nelle mucose e infetta le cellule più profonde. Se il sistema immunitario non riesce a eliminarlo, il virus entra in fase latente, restando nascosto senza causare sintomi. Se invece il virus è di un tipo "ad alto rischio", può spingere la cellula verso la trasformazione tumorale. Quando si attiva, il virus comincia a replicarsi e possono comparire lesioni visibili.

I virus animali a RNA

I virus a RNA hanno come materiale genetico una o due catene di RNA. Esistono molti tipi di virus a RNA e ognuno ha un proprio modo per infettare le cellule e riprodursi.

SARS-CoV-2

Questo virus causa la malattia chiamata COVID-19 ed è un tipo di coronavirus. Il suo RNA è a singolo filamento ed è racchiuso dentro un pericapside su cui si trovano le proteine spike, che servono per attaccarsi ai recettori ACE2 delle cellule umane.

Una volta che il virus entra nella cellula, il suo RNA viene tradotto subito in proteine dalla cellula stessa. Si formano due grandi poliproteine, pp1a e pp1ab, che vengono tagliate in pezzi più piccoli da speciali enzimi. Questi pezzi aiutano il virus a:

• Copiare il proprio RNA,
• Produrre RNA più corti (chiamati subgenomici) che servono per creare le proteine necessarie al capside e al pericapside.

Quando tutto è pronto, il virus si assembla e esce dalla cellula gemmando, cioè rivestendosi con un pezzo della membrana della cellula stessa.

HIV

L'HIV è un virus a RNA molto particolare, appartenente ai retrovirus. È il responsabile dell'AIDS. Quando entra in una cellula, usa un enzima chiamato trascrittasi inversa per trasformare il suo RNA in DNA a doppio filamento. Questo DNA virale si inserisce nel DNA della cellula e forma un provirus in fase di latenza.

Quando l'HIV si risveglia, entra nella fase litica. La cellula inizia a leggere i geni del virus e produce un trascritto primario, che viene modificato dallo splicesoma, cioè un complesso cellulare che taglia e cuce gli RNA.

Da questo processo si ottengono due proteine importanti:

• Tat, che fa aumentare la trascrizione dei geni virali,
• Rev, che regola quali RNA devono uscire dal nucleo.

L'HIV deve produrre due tipi di RNA:

1. Quelli senza introni, che servono per creare Tat e Rev,
2. Quelli completi, che servono per fare le proteine strutturali del virus e creare nuovi genomi virali.

Di solito, gli RNA con introni non possono uscire dal nucleo. Ma grazie a Rev, che si lega all'RNA virale, questi RNA riescono a sfuggire ai controlli e a uscire dal nucleo, pronti per essere usati nella formazione di nuovi virus.