Le cellule staminali: classificazione e applicazioni in medicina rigenerativa

Le cellule staminali in clinica

Quando parliamo di staminali applicate in clinica non bisogna avere paura perché di fatto noi discendiamo da due cellule staminali che danno origine ad un'unica cellula che dividendosi porta alla formazione di un organismo. Potenzialmente, da una singola cellula, noi otteniamo tessuti completamente diversi: da cellule immobili (come gli osteoblasti) a cellule che trasmettono segnali elettrici (come i neuroni), o ancora, cellule che si contraggono (come i cardiomiociti). Deve essere ben presente l'importanza dei tempi biologici: quando il paziente vi chiederà le staminali in una settimana bisogna essere consapevoli del fatto che non è possibile, noi impieghiamo nove mesi per poterci sviluppare e questa caratteristiche accomuna tutti i mammiferi. Infatti, altre tipologie di animali come le lucertole o l'axolotl possiedono una rapida capacità rigenerativa rispettivamente della coda e dell'arto e per questo sono largamente studiati in laboratorio. Noi non abbiamo questa capacità, ma riusciamo a guarire e rigenerare dei tessuti grazie alle cellule staminali. Quando ci troviamo all'interno del corpo materno queste cellule continuano a proliferare e differenziarsi, ma non appena diventiamo adulti si nascondono in strutture che prendono il nome di nicchie in cui sono protette da segnali esterni che le inducono a differenziarsi. Tessuti diversi si generano in tempi diversi: la pelle si rinnova completamente ogni 28 giorni (le cellule dallo strato basale crescono e si differenziano in senso verticale accumulando cheratina), i globuli rossi in 120 giorni (nascono dal midollo, escono, vanno in circolo e poi a morire nella milza), peli e capelli si ricostituiscono completamente dai 2 ai 6 anni (tranne in caso di alopecia in cui il bulbo pilifero è morto), l'epitelio intestinale ogni 2/3 giorni.

Tutti questi tessuti sono sottoposti a stress continui: la pelle deve proteggerci costantemente dagli agenti esterni, i globuli rossi devono prendere e cedere O2 e CO2, l'epitelio intestinale deve assorbire i nutrienti e viene a contatto con pH acidi o ancora l'epitelio polmonare. Tutto ciò che genera stress può indurre mutazioni e non è un caso se le principali sedi di alcuni tumori sono colon e polmoni, i quali, avendo la capacità di rigenerarsi, conterranno cellule staminali non protette dalla nicchia che potranno subire mutazioni diventando tumorali. Per questo motivo le applicazioni della medicina delle cellule staminali richiede un controllo molto rigido che viene svolto dall'agenzia europea del farmaco (EMA) e per l'Italia dall'agenzia Italiana del farmaco (AIFA).

Considerando una cellula come organismo complesso in cui abbiamo espressione genica, sintesi proteica, sintesi dei miRNA viene paragonato il prodotto di terapia cellulare ad un farmaco. Ne deriva che i termini per utilizzare le cellule staminali nell'uomo sono stringenti e risulta necessario fare dei dossier, ovvero una documentazione completa di quello che riguarda la sicurezza di queste cellule.

1. Dispositivi medici o biomateriali come membrane, che contengono staminali da donatori, non sono autorizzati.

Invecchiamento e cellule staminali

Le cellule staminali sono alla base della nostra sopravvivenza, senza di loro non avremmo possibilità di INVECCHIAMO PERCHE' LE NOSTRE STAMINALI INVECCHIANO rinnovare gli epiteli o i globuli rossi. L'invecchiamento è dato dall'invecchiare delle cellule staminali. Tutte le cellule A inizialmente hanno una crescita esponenziale Bambino fino a quando non raggiungono un plateau in C cui non si rinnovano più. Si nota in figura la 50 Bambino Adulto differenza tra le staminali di un bambino e Adulto P po quelle di un anziano, in cui tutti i processi E Cumulative Doubling Anziano sono più rallentati. Anziano 19 25 P5 Passage Number Zaim et al., Ann Hematol 2012

La principale caratteristica delle staminali è l'autorigenerazione: essa dà origine a due cellule figlie non identiche. Siamo abituati a pensare che un adipocita si divida in due adipociti identici ma le staminali no, perché dobbiamo avere una nicchia sempre piena. Per questo motivo una cellula diventerà staminale e rimarrà nella nicchia mentre l'altra андrà a differenziarsi nel tessuto che deve rigenerare. Man mano che si dividono perdono la loro specializzazione partendo dall'essere totipotenti, poi pluripotenti, multipotenti e oligopotenti.

Ricerca e cellule staminali pluripotenti indotte

È stato scoperto (ne è valso anche il premio Nobel per la ricerca) che prendendo cellule adulte, i fibroblasti, e andando a modificare il contenuto è possibile farle tornare indietro rendendole IPSC (Induced Pluripotent Stem Cell). Questo ci è utile nella ricerca perché è illegale quella su embrioni, persino quelli scartati durante le pratiche di fecondazione assistita. Per studiare malattie genetiche, che si sono sviluppate nel corso l'evoluzione, ed evitare di accorgersi solo quando sono già state sviluppate, è necessario avere a disposizione cellule embrionali il più vicino possibile alla patologia. Attraverso una piccola biopsia della cute del malato preleviamo dei fibroblasti che si fanno tornare allo stato staminale per studiarne il differenziamento.

Classificazione delle cellule staminali

Da un punto di vista di classificazione possiamo distinguere le cellule staminali in embrionali, ovvero quelle della blastocisti, e quelle adulte. Nella blastocisti vengono prelevate quelle della massa interna, poste in laboratorio e quindi in condizioni controllate per temperatura, stimoli meccanici, fattori di crescita e così via per farle diventare le cellule che devo andare a studiare.

Le principali fonti di cellule staminali nei tessuti adulti sono cervello, cornea, sangue, midollo osseo, (la donazione del trapianto del midollo per salvare i pazienti con la leucemia non è altro che il trasferimento delle 2staminali dei linfociti da un paziente all'altro), fegato, muscolo, pelle e di particolare importanza tessuto adiposo.

Le più comuni staminali

Nell'immagine a fianco vediamo il midollo, fonte di due tipologie di le Ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells: HSC) le Mesenchimali (Mesenchymal Stromal/Stem Cells: MSC) cellule staminali: le ematopoietiche che crescono in sospensione e danno origine ai linfociti e le Midollo Osseo mesenchimali, le più utilizzate nella HSC medicina rigenerativa. L'unico tessuto che non siamo ancora riusciti MSC a rigenerare sono i globuli rossi BIOPSIA OSSEA (H&E) perchè non siamo riusciti a ricreare la nicchia ematopoietica per avere la quantità di sangue sufficiente a garantire un trapianto. Le cellule mesenchimali hanno una forma a rete e aderiscono alla piastra. La medicina rigenerativa oltre ai biomateriali utilizza le cellule per fare terapia cellulare, quindi ricostruire il tessuto nuovo, oppure terapia genica, recentemente utilizzata con gli ultimi vaccini per trasferire mRNA e convincere la nostra cellula a produrre una determinata proteina. Prima i vaccini venivano sviluppati portando una proteina per stimolare il riconoscimento di quest'ultima da parte del nostro sistema immunitario.

Dominici M et al. JBR 2001, PNAS 2004, Cytotherapy 2013

Processo della terapia genica

Il processo della terapia genica prevede che in una struttura certificata riconosciuta da EMA e AIFA (ricordiamo che le terapie geniche per uomo possono essere effettuate solo in centri autorizzati) si prelevi un campione che può essere tessuto adiposo, cornea o midollo osseo, e nel laboratorio autorizzato avremo amplificazione ed infine trapianto. Le cellule staminali mesenchimali sono le più plastiche in questa forma di terapia perché si amplificano velocemente e noi abbiamo bisogno di grandi quantità di cellule. Queste, abbinate ai diversi biomateriali, possono dare origine a tessuto osseo e adiposo, muscolo, nervo, cornea, trachea, pelle ... Altra tecnica di utilizzo che non prevede biomateriali è quella di iniettarle nel sito del danno, ovvero un tessuto che si sta danneggiando a causa di infiammazione cronica, per sfruttare la principale caratteristica di queste cellule, ovvero l'attività di immunomodulazione che permette di spegnere l'infiammazione in maniera naturale. Nella pratica clinica le principali fonti delle cellule mesenchimali sono midollo osseo e tessuto adiposo.

Importanza del tessuto adiposo

Il tessuto adiposo fino a poco tempo fa veniva considerato un tessuto di scarto sfruttato solo per accumulare energia e fornire sostegno meccanico e protezione ad organi come i reni. Recentemente si è scoperto essere un'ottima fonte di cellule mesenchimali che vengono prelevate attraverso aspirazione.

Isolamento delle cellule dal midollo osseo

3Per isolare le cellule dal midollo osseo bisogna fare l'agoaspirato: esso prevede l'anestesia del paziente e il prelievo del midollo dalle ossa lunghe della cresta iliaca, con ospedalizzazione e possibili complicanze date dall'intervento. Naturalmente il tessuto che preleviamo non contiene solo le cellule di nostro interesse e le regole che sono state definite a livello internazionale richiedono di essere sicuri di isolare le mesenchimali dalle altre staminali presenti nella nicchia. Il principale criterio definito da EMA e AIFA è che siano negative per un marcatore, CD34, che caratterizza le ematopoietiche. Altra norma è che le cellule del donatore prima di essere amplificate debbano aderire e aver la tipica forma fusiforme dei fibroblasti. È necessario rilasciare un certificato al paziente per stabilire che attraverso l'uso di un citoflorimetro le cellule siano marcate da CD73, CD90, CD105. Infine, bisogna caratterizzare queste cellule in laboratorio per stabilire che si differenziano in tessuto osseo, adiposo e cartilagineo.

Morfologia allungata p3 p5 A B 100 m C D ma consente di sapere quante Tutto questo richiede del tempo Marcatori al citofluorimetro A 8.0 OD570 nm 0,0 BM ODM 1 12 URM BODM - o ALPL OC OPN 05x RANKL RUNX2 C 1,6 ... - OD570 nm 0.0 BM ODM -- 28act BM ODM 0 ALP OC OPN RANKL RUNX cellule sono state amplificate e soprattutto se sono effettivamente mesenchimali.

Evidenza clinica delle mesenchimali

Una evidenza clinica ormai accettata è che le mesenchimali in laboratorio si differenziano nel tessuto che vogliamo, mentre in vivo non avviene la stessa cosa. Si sono fatti migliaia di medical trials in cui si somministravano le mesenchimali fluorescenti, il paziente inizialmente stava meglio ma nel tessuto rigenerato non c'era un segno di fluorescenza. Questo avviene perché le mesenchimali, una volta arrivati nel sito danneggiato, rilasciano fattori immunomodulanti che coordinano la rigenerazione in loco.

Ruolo del tessuto adiposo nella rigenerazione

Ad oggi il tessuto adiposo riveste un ruolo molto importante perché contiene fattori che controllano il sistema immunitario e favoriscono l'angiogenesi, necessaria alla rigenerazione. Il tessuto adiposo è lo specchio della condizione generale del paziente ed è per questo che in pazienti obesi è ricchissimo di citochine infiammatorie che portano ad una predisposizione a infiammazione e complicazioni cardiovascolari, come l'attivazione scoordinata delle piastrine e la formazione di coaguli. Una volta prelevato il tessuto di un paziente con queste caratteristiche dobbiamo dare il tempo di perdere l'infiammazione in laboratorio. Questo tessuto contiene molti fattori pro-rigenerativi, come cellule del sistema immunitario (macrofagi), innervazione, capillari, matrice extracellulare contenente collagene e infine cellule mesenchimali staminali, biologicamente identiche a quelle 4 Capacità di differenziare in vitro p A E