Regolazione della biosintesi: ruolo della glutammina, appunti universitari

Biochimica, Lezione 43, 28/10/2021

Prof.ssa Penolazzi

Regolazione della biosintesi: ruolo della glutammina

Con la lezione di oggi non si introdurranno nuovi argomenti, ma si raccoglieranno le idee riguardo le informazioni acquisite nelle lezioni precedenti.

La fonte di ammoniaca

Il maggiore trasportatore ematico dello ione ammonio è la glutammina e, in particolari condizioni, anche l'alanina. Dall'altra parte, il gruppo amminico è presente in molecole, quali:

• amminoacidi, dove l'ammoniaca viene liberata a seguito dell'azione di transaminasi e glutammato deidrogenasi;
• ammine, grazie all'azione dell'ammino ossidasi;
• nella biosintesi di basi azotate quali purine e pirimidine;
• si trova inoltre all'interno del nostro organismo a livello intestinale, poiché prodotta dall'ureasi batterica. Si ha la scissione dell'urea con produzione di anidride carbonica e ione ammonio

Il destino dello ione ammonio

Il destino che può avere lo ione ammonio è definito da tre molecole: alfa-chetoglutarato, glutammato e glutammina.

NH.+ Carbamilfosfato sintasi I 2ATP + HCO 3 2ADP + Pi + 2H + Glutamato deidrogenasi a-chetoglutarato H,N NADH NAD(P)H NADPH (GDH) O O H2O NAD+ NAD(P)+ NADP+ Glutamina sintasi O O 0 NH,+ Glutamato ADP + Pi ,HN NHỊ+ Glutamina

Lo ione ammonio forma il carbamilfosfato grazie all'azione della carbamilfosfato sintetasi I, enzima che si trova a livello dei mitocondri degli epatociti. Questa reazione dà l'innesco al ciclo dell'urea.

1 CarbamilfosfatoDall'altra parte, si nota lo ione ammonio coinvolto nel sistema della glutammato deidrogenasi (nell'immagine è presentato nel verso di produzione del glutammato): lo ione ammonio, unito all'alfa-chetoglutarato, darà il glutammato. Infine, si nota la reazione catalizzata dalla glutammina sintasi, la quale, a partire da ione ammonio e glutammato, dà come risultato la glutammina.

Regolazione della biosintesi

I meccanismi di reazione della biosintesi possono essere raggruppati in

• Transaminazione
• Trasferimento gruppo amminico

Trasferimento unità carboniose Un principio che deve essere assolutamente rispettato è che gli amminoacidi devono essere sintetizzati nelle giuste concentrazioni. Ciò significa che non esiste una riserva di amminoacidi all'interno della cellula: gli amminoacidi devono essere prodotti ed utilizzati, e soprattutto devono essere prodotti in concentrazioni adeguate. È necessaria quindi una precisa regolazione, che si può declinare in due punti chiave: da una parte, l'inibizione a feedback. Se la quantità dell'amminoacido è sufficiente, non c'è bisogno che questo continui ad essere prodotto. L'inibizione a feedback si esprime tramite lo sviluppo di sistemi trasversali di regolazione (ad es. inibizione della treonina sequenziale retroattiva: ci sono una serie di step intermedi che portano all'amminoacido, i quali vengono regolati trasversalmente tramite diverse vie di biosintesi, che portano anche ad amminoacidi diversi. In questo modo c'è una regolazione trasversale. La professoressa non è entrata nei dettagli). Il secondo punto chiave è rappresentato dalla regolazione dell'espressione genica (metabolomica): esiste una parte della regolazione che va ad operare a livello dell'enzima coinvolto nella sintesi. Ad esempio: se per far avvenire la sintesi della glutammina è necessaria la glutammina sintetasi, un fattore limitante della glutammina sintetasi può essere sia la presenza elevata di glutammina, ma anche quanto enzima è presente: la cellula può avere una grande quantità di glutammato (che porterebbe alla formazione di glutammina) tuttavia la glutammina sintetasi non c'è, o c'è in poca quantità, non viene prodotta glutammina (tappa di regolazione). La glutammina sintetasi insieme allo sviluppo dei sistemi di regolazione trasversale, rappresenta la tappa più importante della biosintesi degli amminoacidi. All'interno della cellula, le concentrazioni di glutammina e glutammato sono molto maggiori, ciò deriva dal fatto che queste molecole sono molecole chiave nel trasporto dello ione ammonio.

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Assorbimento degli amminoacidi

Un altro punto che può condizionare la disponibilità di amminoacidi a livello cellulare, e di conseguenza la quantità di amminoacidi che arriveranno al torrente ematico, è la regolazione dell'assorbimento degli amminoacidi (amminoacidi che vengono assunti attraverso la dieta e quindi non di neosintesi). In particolare, il primo step dell'assorbimento cellulare degli amminoacidi introdotti attraverso la dieta è legato alle cellule dell'epitelio intestinale, gli enterociti. Il trasporto degli amminoacidi avviene solitamente attraverso il sistema di simporto sodio-amminoacidi: il sodio sappiamo essere maggiormente concentrato a livello extracellulare. Il sodio tende spontaneamente ad entrare nella cellula (dove la sua concentrazione è minore) e questa spinta fornisce l'energia necessaria per far sì che l'amminoacido entri nella cellula. La concentrazione dell'amminoacido all'interno della cellula è superiore rispetto all'esterno, questo perché viene sfruttata l'energia data dalla variazione di concentrazione del sodio.

Intestinal Lumen Amino Acid Nã Na Co-transporter Brush Border Active transporter Enterocyta Nat Amino Acid ATP Na ADP + P K Facilitative transporter Portal Vein

Rappresentazione di un enterocita e del simporto sodio-amminoacido. La quantità di copie di strutture proteiche caratterizzanti i trasportatori determina la disponibilità di amminoacidi all'interno della cellula stessa.

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I trasportatori degli amminoacidi

L-AA® L-AA® Na* LAT1 L-AAº y'LAT2 L-AA* H S-AA" AA+ SLC38A9 AA Pool CAT1 L-AAº, Arg GCN2 Arg Leu (mTORC1 xCT Glu Glu Gin Lysosome Cys-Cys S-AAO S/M-AAº ASCT1 ASCT2 SNAT1 SNAT2 S-AAº S/M-AAº Nat Na* S/M-AAº

Nell'immagine soprastante, vengono evidenziati alcuni trasportatori degli amminoacidi a livello di una cellula tumorale. Gli amminoacidi rappresentano infatti un sensibile segnale anabolico poiché rivestono il ruolo di intermedi di svariate vie metaboliche. Nel caso di una cellula tumorale, quindi in stato di forte crescita, la sua proliferazione e la sua attività dipende anche da quanti trasportatori di amminoacidi sono presenti sulla membrana. Nell'immagine sopra riportata vengono rappresentati con diverse caratteristiche macroscopiche, poiché ognuno sarà specifico per diversi tipi di amminoacidi. Tutti poi arrivano alla glutammina, poi al glutammato. Il fatto di avere certe concentrazioni di glutammato e glutammina all'interno della cellula, può rivestire il ruolo di forti segnali anabolici. Il glutammato può contribuire alla formazione di alfa-chetoglutarato e successivamente, l'ammoniaca, con la formazione del carbammilfosfato, tende al ciclo dell'urea. La glutammina sintetasi, catalizzando la reazione tra glutammato e ammoniaca, porta al trasporto della glutammina nei vari tessuti, e al mantenimento di adeguati sistemi tampone. La glutammina poi, può contribuire alla formazione di glutammato grazie all'azione della glutamminasi (che può essere renale -KGA- o epatica -LGA-). Il fatto che glutammato e glutammina siano presenti in questi processi è indicatore del loro ruolo chiave nel condizionare la crescita cellulare e la loro proliferazione in caso di cellula tumorale.

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Clinica

Se c'è uno squilibrio dei livelli di glutammato e glutammina, si possono innescare dei meccanismi di tossicità: a livello del tessuto nervoso. Nel caso di elevata concentrazione di ammoniaca, si attiva l'azione della glutammina sintetasi, la quale, per evitare una situazione di tossicità, svolge un'azione detox sulle cellule. La glutammina sintasi va, quindi, a togliere l'ammoniaca in eccesso, sottraendo glutammato da queste cellule. Questo sistema ha una doppia problematica:

• Il glutammato è il precursore del GABA (acido y-amminobutirrico), un y-amminoacido, principale neurotrasmettitore inibitorio nei mammiferi, del sistema nervoso centrale.
• Togliere il glutammato dal sistema fa sì che porti la glutammato deidrogenasi a funzionare in senso contrario: per cui l'assenza di glutammato sposta la reazione verso l'utilizzo dell'a-chetoglutarato, per la biosintesi di glutammato, e questo toglie a-chetoglutarato a livello del tessuto nervoso determinando un'alterazione del metabolismo energetico a livello di questo tessuto.

Questo per dire che, se l'equilibrio di glutammina-glutammato non è adeguato, non solo ci può essere una spinta verso la proliferazione e una crescita spropositata (come vedremo nel corso della lezione).

Glutammina

Da dove viene la spinta energetica della glutammina?

La glutammina entra a livello della cellula grazie all'azione di due categorie di glutaminasi, una a livello mitocondriale e una a livello citoplasmatico:

• a livello citoplasmatico, la glutaminasi porta a formazione di glutammato, poi alfa-chetoglutarato, citrato, isocitrato e va a contribuire, attraverso l'enzima malico, alla produzione di NADPH, oltre che alla produzione, attraverso la citrato liasi, di acetil-coenzima A. Acetil-CoA e NADPH danno una notevole spinta verso la produzione di acidi grassi. La glutammina può inoltre portare alla formazione di esosammine, le quali sono molecole che hanno un ruolo anche nella regolazione dell'espressione genica oltre che contribuire nella biosintesi di asparagina.
• A livello mitocondriale, la formazione di glutammato grazie all'azione della glutamminasi, in seguito si arriva alla formazione di alfa-chetoglurato, che entra immediatamente nel ciclo di Krebs (spinta metabolica energetica importante). E ancora, il glutammato, può essere spinto verso la produzione di glutatione.

Il processo di glutaminolisi, sia a livello della cellula che epatico, è un processo sfruttato dalle cellule tumorali per alimentare la loro crescita e accelerarne la proliferazione.

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glutamine the glutamine leucine SLC1A5 HEXOSAMINE BIOSYNTHESIS × (UDP-GIcNAc) amino transferases glutamate GLS glutamine leucine 2-oxoglutarate IDH1 + NADPH 4 NADP isocitrate mTORC1 activation aspartate GLS2 acetyl-CoA + citrate- PROLINE ALANINE ASPARTATE OAA OAA NADP: 4 IDH2 malate NADPH GLUD FATTY ACID BIOSYNTHESIS TCA cycle MDH 2-oxoglutarate fumarate succinate malate mitochondrion NUCLEOTIDE NADPH. pyruvate BIOSYNTHESIS

La prof. puntualizza che, in laboratorio, su un terreno di coltura, la glutammina deve essere aggiunta fresca, per garantire la proliferazione e il mantenimento in vitro di queste cellule.

Regolazione dell'espressione genica della glutammina

La glutammina interviene nella regolazione dell'espressione genica all'interno di vari tipi di cellule diverse, andando a regolare vari funzioni biologiche, come mostrato nella tabella a fianco.

Cells / Organs Function Target molecules Pancreatic beta cells Insulin secretion Calcineurin, Pdx1 Acetyl CoA Carboxylase Lipid synthesis FAS , GPDH Adipocytes Insulin action PK Endothelial cells Nitric oxide synthesis GFAT Vascular smooth muscle Cytokines production TGFa , bFGF Fibroblasts Production of ECM al collagen , a III collagen , collagen Inflammatory response TNF&, IL6, IL1ß Monocytes Cell death repair HSP70, HSP25, HSP72 Apoptosis Fas, FasL, CD45RO, Bcl2 Lymphocytes Inflammatory response TNF&, CD25, CD45RO,CD71, INF*/ Apoptosis Bcl2, BclxS , Bax Neutrophyls Respiratory burst p22 phox , p47 phox, gp91pho Cytokine TGF1 Kidney Production of ECM Cx-SMA fibronectin Gluconeogenesis G6Pase , PEPCK Liver Cell swelling Gluconeogenesis Urea cycle Transporter ß-actin , PEPCK , ASS ASCT2, ACC , GS, x2M Lypogenesis Glycogen synthesis Cytokines Protein degradation Ubiquitin Intestine Cell proliferation AP1dependent genes Urea cycle ASS Contractility a-actin, &MHC Heart Energy supply CPT1 Cell proliferation ADSS1 licalbioch glutamine ASPARAGINE GLUTAMATE ATP-citrate lyase NH * isocitrate glutamate GLUTATHIONE (antioxidant) NH+ amino transferases ME1 GLUTAMINE Gene expression regulation type IV collagen SLC3A2/ SLCZAS (LAT1) glutamine

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