Raccolta del campione, organizzazione dei laboratori e metodo analitico

Raccolta del Campione

Matrici Biologiche

Per quanto concerne la raccolta delle urine nelle ventiquattro ore, il coinvolgimento del paziente è fondamentale per ottenere un risultato ottimale. Il campione va infatti raccolto in un arco di tempo corretto, in un contenitore pulito e deve raggiungere un dato volume.

Prelievo Ematico

La fase preclinica riveste un'enorme importanza perché è la fase in cui avviene la maggior parte degli errori diagnostici ed è sotto il controllo del laboratorio analisi soltanto in parte. La fase pre analitica è rappresentata dalla preparazione del paziente e dall'accettazione. In questa fase si deve attuare una distinzione fra il paziente ospedalizzato e il paziente che si reca in autonomia nella struttura preposta ai prelievi. Il medico deve insegnare al paziente non ospedalizzato quali sono i comportamenti da attuare prima di sottoporsi al prelievo. Questo passaggio è necessario perché bisogna standardizzare i vari comportamenti per ottenere risultati omogenei. Tra questi comportamenti ricordiamo che il prelievo va effettuato la mattina a digiuno. Una volta giunto al centro prelievi il paziente va identificato, dopo di che si effettua l'accettazione (inserire nel computer gli esami che il paziente deve fare). Questa operazione è importante perché sovente i medici sbagliano ad inserire i codici degli esami. A seguito dell'accettazione si preparano le provette, queste devono essere etichettate con nome e cognome del paziente, dati anagrafici e codice a barre dell'esame da svolgere per evitare errori. Può capitare che prelievi provenienti da RSA arrivino con il nome scritto a mano, questo è un problema perché i dati anagrafici devono essere chiari e leggibili. Il momento del prelievo deve seguire tutti gli standard:

• Seduto su una poltrona per standardizzare anche la posizione
• Laccio seguendo il protocollo di inserimento e rimozione per evitare di alterare il prelievo.
• L'ago deve essere di una grandezza adeguata (né troppo grande né troppo piccolo) per controllare la velocità (e la forza) del prelievo.

1 Non palpare manualmente la vena dopo la pulizia! 2 / Far distendere il braccio del paziente in modo che sia rivolto verso il basso. 3 Usare la mano libera per inserire la provetta sottovuoto nella camicia spingendo la stessa finché l'ago penetri la parte di gomma del tappo. Far liberare il braccio da costrizioni dovute a capi di vestiario. Effettuare la puntura con l'ago a un angolo di 10-20° rispetto alla pele ed in linea con la vena scelta. Inserire l'ago 10-15 mm fino a che non raggiunga il lume della vena: un improvviso cedimento indica la penetrazione dell'ago nel lume vasale. 4 5 6 Dopo aver prelevato l'ultima provetta, estrarre l'ago dalla vena e tamponare con un batuffolo Allentare il laccio emostatico nel momento in cui si vede del sangue nella provetta. Mantenere una delicata pressione sul fondo della provetta per mantenerla in sede nella camicia Quando il flusso di sangue cessa e la prima provetta è piena rimuoverla delicatamente dall'holder e inserire le altre provette nella camicia rispettando la sequenza raccomandata di seguito (vedi Ordine di Prelievo). Dopo aver prelevato l'ultima provetta, rilasciare il laccio (se non già fatto prima). -- 1Leggere attentamente la slide sovrastante, in quanto il professore ha elencato pedissequamente tutte le fasi del prelievo. È necessario scegliere accuratamente la provetta con cui si conserverà il campione per fare in modo che contenga gli additivi giusti. Bisogna innanzitutto distinguere se per il dato esame si ha bisogno di sangue coagulato o no. Se non deve coagulare, le provette devono contenere un anticoagulante adatto al tipo di esame da effettuare. Nei casi in cui si ha bisogno del siero, quindi del sangue coagulato, spesso non si ha nulla all'interno della provetta (la coagulazione si attiva direttamente a contatto con il vetro), mentre in alcuni casi può contenere una sostanza che attivi la coagulazione per essere certi che questa avvenga in una maniera adeguata. Il prelievo del sangue e l'inserimento nelle provette dovrebbe seguire un ordine prestabilito a seconda del tipo di esame da sostenere. Il CLSI suggerisce la sequenza che segue:

1. Le provette destinate all'emocoltura (tappo giallo o giallo-nero).
2. Le provette contenenti sodio-citrato destinate ad esami di coagulazione (tappo azzurro). Plasma-coagulazione
3. Le provette di siero con o senza attivatore della coagulazione (tappo rosso). Siero-biochimica
4. Le provette contenenti litio-eparina (tappo verde scuro). Plasma-biochimica
5. Le provette contenenti EDTA (acido etilendiamminotetracetico) (tappo lavanda). Cellule-ematologia
6. Le provette contenenti citrato e destrosio (tappo giallo pallido)
7. Le provette contenenti ossalato e/o fluoruro (tappo grigio chiaro)

L'emocoltura andrebbe effettuata per prima per evitare un'eventuale contaminazione (situazione piuttosto frequente). In secondo luogo si prendono provette per esami complicati come quelli della coagulazione ed infine gli esami riguardanti le cellule.

Anticoagulanti

Eparina (Biochimica)

È un anticoagulante che attiva l'antitrombina (anticoagulante naturale) per cui blocca in maniera irreversibile la coagulazione. Poiché è irreversibile non si può utilizzare per gli esami della coagulazione. Tende inoltre ad:

• Alterare la morfologia di alcuni globuli bianchi, tra cui la morfologia e colorazione dei leucociti
• Provoca l'aggregazione delle piastrine

È l'anticoagulante che interferisce di meno con le determinazioni enzimatiche. La concentrazione ottimale è di 0.1-0.2/1 ml di sangue. In un prelievo per emocromo è preferibile utilizzare il sodio citrato.

Sodio Citrato

Ha il vantaggio di essere reversibile, chela il calcio impedendo l'inizio del processo di coagulazione (migliore per questa indagine). Se si volesse esaminare in un secondo momento la coagulazione basterebbe aggiungere il calcio per far ripartire la reazione. Per gli esami di coagulazione il rapporto fra citrato (presente nella provetta) e il sangue è fondamentale. Se si aggiunge una quantità fissa di calcio ad una provetta con una quantità di sangue variabile si avranno risultati non attendibili. Gli infermieri del centro prelievi non commettono quasi mai errori per quanto concerne il volume di sangue nelle provette, non si può dire lo stesso degli infermieri di reparto o di quelli privati perciò sovente il campione non risulta idoneo. La dicitura è "campione non compatibile, ripetere l'esame". Sicuramente una componente che influisce in questi campioni non idonei è spesso la condizione del paziente. 2Per isolare la componente liquida del sangue si deve centrifugare la provetta, in questo modo la componente corpuscolare precipita (globuli rossi e bianchi). La centrifugazione deve avvenire dopo circa mezz'ora dal prelievo (ma entro l'ora) a 3000 rpm per dieci minuti.

• Centrifugazione

V Attendere 30 min dal prelievo v Max 1h dal prelievo centrifugare a 3000 rpm per 10min SIERO Albumina Acqua Proteine Lipidi Fibrinogeno Fattori della coagulazione Anticorpi PLASMA (anticoagulante) 5% plasma Glucosio Am inoacidi loni Sostanze di rifiuto " Neutrofili Eosinoti ~ 1% buffy coat Globuli bianchi Monociti Piastrine Linfociti 44% globuli rossi presentano i vantaggi dell'uno e dell'altro per quanto concerne l'esecuzione dei dosaggi di laboratorio. PLASMA EPARINATO SIERO Campione più rappresentativo della situazione in vivo per la presenza dei fattori della coagulazione. Assenza totale di elementi cellulari dopo la centrifugazione. Riduzione del "turnaround time (TAT)" soprattutto per gli esami d'urgenza. Si può centrifugare subito senza aspettare che il sangue coaguli. Maggior stabilità del campione in assenza di gel separatore. Minor rischio di malposizionamento del gel (o di altro materiale) separatore. Assenza di anticoagulante. Eliminazione di interferenze da fibrina. Possibilità di utilizzare il campione per l'elettroforesi sieroproteica. Maggior resa del campione. Minor rischio di attivazione da caldo e/o freddo dei fattori della coagulazione. Si può inoltre congelare a differenza del plasma. Numero più ampio di metodi validati su questa matrice. Emolisi La componente liquida sarà plasma se il sangue è scoagulato (se è presente anticoagulante) e sarà siero se il sangue è coagolato. Alcuni esami vengono fatti sul siero altri sul plasma. Nella tabella sottostante si Il siero è un liquido molto stabile e pertanto la maggior parte degli esami può essere effettuato dopo giorni o addirittura anni, se adeguatamente conservato. Gli esami inviati dalle autorità giudiziarie di persone coinvolte in incidenti stradali, indagano la presenza di droghe, psicofarmaci ed alcol. Le provette vengono inviate seguendo il protocollo della catena di custodia (si firma ad ogni passaggio la ricezione delle provette) assicurandosi così che non ci siano scambi e che arrivi a 3destinazione. Al laboratorio arrivano tre provette, con la prima si fa un'indagine di primo livello (non molto precisa) se risulta positiva l'esame viene confermato con un secondo test più accurato e la terza provetta si conserva sigillata per almeno cinque anni in frigorifero. Questa terza provetta può essere utilizzata per un'eventuale conferma o per un'indagine, a cura della difesa, di rianalisi del campione.

Fase Analitica

I test e kit analitici sono spesso validati per il siero e non per il plasma. A seconda del tipo di esame quindi il liquido utilizzato è definito dal kit stesso in quanto non sono intercambiabili. Se il T.A.T. (Turn around time) non è urgente, si può avere l'esito anche nei giorni successivi. Se l'esame è raro si fa una corsa analitica unica per tutti consegnando gli esiti al paziente con calma. La troponina è un esame che viene effettuato immediatamente in quanto indica la presenza di un infarto; permette di delineare le indagini immediatamente successive (come una coronarografia) e di eventualmente salvare la vita del paziente. La troponina si fa su plasma. NORMAL HEMOLYTIC ICTERIC LIPEMIC Nell'immagine. Il primo è un campione fisiologico, descrive ciò che si può vedere osservando una provetta centrifugata. Si può notare la separazione fra la componente cellulare e quella liquida. Il materiale del sangue viene diviso in tre fasi:

1. Rossa: globuli rossi
2. Gialla: il plasma
3. Bianca: è costituita dai globuli bianchi, perché avendo un peso intermedio si interpone fra i due strati e compone il buffy coat. Qui si trovano linfociti, monociti, leucociti.

Durante la procedura di aferesi si prelevano 500 ml di sangue che verrà centrifugato; da una parte prelevano plasma (nel quale si trovano le piastrine perchè la centrifugazione avviene a basse velocità), dall'altra i globuli rossi e il buffy coat viene buttato. Si possono fare anche la plasmaferesi, la piastrinoaferesi e la leucoaferesi; per fare ciò si lavora sulle differenti velocità di sedimentazione dei vari componenti del sangue. Tutto il resto che non viene prelevato si reinfonde in circolo con il citrato per evitare il rischio di coaguli. Il secondo campione appare strano perché il plasma risulta rosato (i livelli di rosa possono variare). Questo è un campione che si è emolizzato (i globuli rossi si sono rotti) pertanto non si può usare per diverse analisi perché comporta alcune alterazioni. 4