Cromatografia: Principi Generali e Meccanismi di Separazione

CROMATOGRAFIA

Parte 1

1. Principi generali
2. Meccanismi chimico-fisici della separazione cromatografica
3. Tecniche cromatografiche

Chimica analitica e strumentale AS 2020-21 Cl 5 ECH

Principi Generali della Cromatografia

La CROMATOGRAFIA è una tecnica di separazione che sfrutta la diversa AFFINITA' dei componenti di una MISCELA per due fasi:

• FASE STAZIONARIA (immobile)
• FASE MOBILE che scorra sulla prima

Stesso principio su cui si basa l'ESTRAZIONE CON SOLVENTE Questa tecnica viene utilizzata quando Devo separare i componenti di una miscela Chimica di sintesi :farmaceutica e industriale (purificazione) Chimica analitica: analisi di matrici reali ( terreni, scarichi, acqua di mare rifiuti, sedimenti, acque potabili e di falda) accoppiata ad una tecnica quali/quantitativa

https://www.youtube.com/watch?v=0m8bWKHmRMM558715 | Elementi di chimica analitica strumentale - EBook Tecniche di analisi per Chimica e materiali - Metodi cromatografici ti Mappe ?

Metodi Cromatografici e Separazione

18 Metodi cromatografici a b A B C A+B+C C B d A 0 50 100 150 200 250 Volume di ritenzione, VR (mL) I C 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 6 7 8 9 . 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 3 25 26 Spostamento dei recipienti per la raccolta delle frazioni . . 9 . 10 11 12 13 14 15 . . . . 20 . . . . · 26 8 16 17 18 19 21 22 23 24 25 Figura 18.2 Esperimento fondamentale della cromatografia. (a) Carica- mento in colonna di una miscela di tre sostanze (A, B e C); la fase stazionaria è saturata dall'eluente. (b) Via via che viene aggiunto l'eluente, i diversi componenti della mi ella miscela si all'uscita della colonna (come indica la freccia, i recipienti di raccolta vengono fatti scorrere da destra a sinistra in figura). Dopo l'evaporazione del solvente le diverse sostanze sono determinate per via gravimetrica. Nell'istogramma otte- Massa di sostanza C- Durante la separazione cromatografica IN OGNI PUNTO DELLA COLONNA, le sostanze si ripartiscono tra la fase mobile e quella stazionaria in un processo di equilibrio dinamico CM M Cs K= C Cs M COSTANTE DI DISTRIBUZIONE Il tempo di eluizione e quindi di conseguenza il volume di eluizione dipendono dal tempo che le molecole trascorrono nella fase stazionaria ESTRAZIONE-TRASCINAMENTO-ESTRAZIONE

Interazioni tra Analita e Fasi

Che cosa intendiamo per affinità? Quali sono le interazioni tra analita e fase stazionaria e analita e fase mobile?

LEGAMI INTERMOLECOLARI

• Legame a idrogeno
• Legami dipolari:
  • Interazione ione-dipolo;
• Interazioni di Van der Waals:
  • Dipolo permanente-dipolo permanente;
  • Dipolo permanente-dipolo indotto;
  • Dipolo istantaneo-dipolo indotto (forze di London)

Legami Dipolari

Interazioni IONE-DIPOLO Interazioni di Van der Waals Sono interazioni di natura elettrostatica. Ogni carica elettrica (ione o dipolo elettrico associato ad una molecola) genera un campo elettrico che può:

i) indurre orientazione di eventuali dipoli presenti; ii) indurre polarizzazione in molecole polari; iii) causare la formazione di dipoli indotti in molecole apolari.

Legame a Idrogeno

H O Polar covalent bond H Hydrogen bond forms between molecules. H H Covalent bond (strong) H F H - Legame a idrogeno

Interazioni Ione-Dipolo: Idratazione dei Cationi

Interazioni ione-dipolo: idratazione dei cationi in acqua Soluzioni di composti ionici (NaCl) in solventi polari (H2O) H 0 H 0 H H O H Na+ O H 0 H 0 H H H H H NaCl +n H2O-> Na(H2O)}++ Cl(H2O)y 11

Interazioni di Van der Waals

Interazioni di Van der Waals Forze di attrazione tra molecole neutre in fase gas, liquida o solida Sono forze a corto raggio di natura elettrostatica

• interazioni dipolo permanente - dipolo permanente
• interazioni dipolo permanente - dipolo indotto
• interazioni dipolo istantaneo - dipolo indotto

Molecole polari Molecole apolari + - - + - + Forze di London + - HCI 9

Legame Dipolo - Dipolo

LEGAME DIPOLO - DIPOLO A+ 4- 4+ 4- 4+ 4- .... - + + - + + + + - ++ + attrazione repulsione

Legame Dipolo Istantaneo - Dipolo Indotto

LEGAME DIPOLO ISTANTANEO - DIPOLO INDOTTO Molecole non polari avvicinamento - diventano polari per l'effetto attrattivo che il nucleo di una molecola esercita sulla nube elettronica di una seconda molecola in avvicinamento 4 - + 4 - 4 +

Meccanismi Chimico-Fisici della Separazione Cromatografica

Meccanismi chimico-fisici della separazione cromatografica Tali meccanismi dipendono dal tipo di fase mobile e liquida e dal tipo di interazioni tra il soluto e le due fasi

ADSORBIMENTO RIPARTIZIONE SCAMBIO IONICO ESCLUSIONE AFFINITA'

ADSORBIMENTO

ADSORBIMENTO Fase stazionaria: solido Fase mobile: liquido (o miscela di liquidi) o gas Tipo di interazioni: legami intermolecolari Soluto adsorbito sulla superficie della fase stazionaria Cromatografia di adsorbimento La fase stazionaria è un solido. Fase mobile (liquido o gas) Siti attivi Fase stazionaria (solido) 10

RIPARTIZIONE

RIPARTIZIONE Fase stazionaria: liquido adeso ad un solido Fase mobile: liquido (o miscela di liquidi) immiscibile con la fase mobile o gas Tipo di interazioni: Legami intermolecolari (solubilità) La fase stazionaria è un liquido che ricopre un supporto solido. Fase mobile (liquido o gas) Soluto disciolto in una fase liquida che riveste la superficie di un supporto solido Fase stazionaria (liquido) Supporto (solido) Cromatografia di ripartizione 11

SCAMBIO IONICO

SCAMBIO IONICO Fase stazionaria: solido su cui sono legati covalentemente anioni o cationi Fase mobile: soluzione (tampone) contenente elettroliti Tipo di interazioni: ione-ione Colonna Fase stazionaria Fase mobile Analita Resine a scambio anionico Cariche positive gruppi amminici quaternari -N(CH3)3+ Una soluzione di carbonato e bicarbonato di sodio (Na2CO3/NaHCO3) o idrossido di potassio (KOH) Anioni Resine a scambio cationico Cariche negative gruppi solfonici -SO3 gruppi carbossilici -COO- una soluzione Acido Metansolfonico (MSA (CH3SO3H) Cationi

La fase stazionaria è un solido che presenta in superficie gruppi che portano una carica elettrostatica, positiva o negativa. + Gli anioni in soluzione nella fase mobile vengono trattenuti dai cationi legati covalentemente alla fase stazionaria + + + + + + + + + x + + + 1 + + + Resina a scambio ionico in forma anionica (attira soltanto gli anioni) Cromatografia di scambio ionico 12

Gli ioni del soluto competono con quelli della fase mobile per legarsi ai gruppi di carica opposta presenti sulla fase stazionaria. a b C Fase mobile Matrice polimerica 1 1 1 Siti attivi Controione 1 1 - I L + + + + + + + + Fase stazionaria N(CH3)3+ 3/3 OH- Cl- R

ESCLUSIONE

ESCLUSIONE Fase stazionaria: solido poroso o gel Fase mobile: liquido Tipo di interazioni: esclusione sterica La tase stazionaria è un solido o un gel che presenta dei pori di dimensioni note ed opportune. Molecole del campione Fase mobile 0 O Fase stazionaria (granuli di gel) Le molecole più grosse non possono entrare nei pori e vengono "eluit" prima di quelle più piccole. 14

AFFINITA'

AFFINITA' Fase stazionaria: solido con ligandi legati covalentemente Fase mobile: liquido Tipo di interazioni: legami covalenti reversibili e specifici, interazione intermolecolari specifiche La fase stazionaria è un solido derivatizzato in superficie con "recettori" in grado di legare solo la molecola in esame. Viene soprattutto utilizzata per la purificazione delle biomolecole (proteine, enzimi) Soltanto un particolare tipo di molecola presente in una miscela complessa si lega agli anticorpi fissati covalentemente alla fase stazionaria Tutte le altre molecole attraversano la colonna senza essere trattenute Cromatografia di affinità 15

Tecniche Cromatografiche

Tecniche cromatografiche FASE MOBILE STRUMENTAZIONE PRINCIPI DI SEPARAZIONE TECNICA Adsorbimento Ripartizione Colonna Scambio ionico CC Column Cromatography Esclusione Affinità Liquido Adsorbimento Strato sottile Ripartizione TLC Thin Layer Cromatography Cromatografo liquido Ripartizione HPLC High Pressure Liquid Cromatography Scambio ionico IC Ionic Cromatography (DIONEX) Gas Gas cromatografo Adsorbimento GC Gascromatography Ripartizione

Domande di Revisione sulla Cromatografia

Rivedere gli appunti di chimica organica e rispondere alle seguenti domande:

1. Che tipo di cromatografia avete utilizzato
2. Su quale meccanismo si basava
3. Quali fasi stazionari avete utilizzato
4. Quali sono i criteri di scelta della fase stazionaria e della fase mobile
5. Come si impaccano le colonne cromatografiche e come si procede sperimentalmente per la separazione
6. Quali sono le principali applicazioni delle cromatografie utilizzate