Struttura e replicazione del DNA: scoperte e meccanismi

Struttura e Replicazione del DNA

23/09/2020
Struttura e
replicazione del DNA
DNA

Caratteristiche del Materiale Genetico

AT-
LO-C
C-G-
G-C-
-A
-A-1

• Capacità di replicarsi accuratamente
• Avere una struttura stabile
• Portare tutta l'informazione biologica
• Trasferire l'informazione biologica a tutte le cellule
• Andare incontro a cambiamenti ereditabili (mutazioni) BASE DELL'EVO
  (DARWIN)

Tappe Fondamentali della Scoperta del DNA

123/09/2020
Tappe fondamentali della scoperta del DNA
e della sua struttura

• 1928: Griffith scopre il "principio trasformante"
• 1944: Avery, McLeod e McCarthy dimostrano che il
  "principio trasformante" nei batteri è DNA
• 1952: Hershey e Chase dimostrano che i fagi
  quando infettano i batteri iniettano il proprio DNA
• 1953: Watson e Crick determinano la struttura a
  doppia elica, sulla base dei dati di Wilkins e Franklin

Struttura di un Batterio

DNA cromosomico
plasmide
@ peter sforza

Plasmide: Molecola di DNA Circolare

molecola di DNA circolare a doppio filamento, presente nel citoplasma dei batteri e
capace di replicarsi indipendentemente dal cromosoma.
I plasmidi contengono le informazioni genetiche 'accessorie' quali la resistenza dei
batteri agli antibiotici

Esperimento di Griffith (1928)

223/09/2020
Esperimento di Griffith (1928)
STESSO
BATTER 10
PUOIDARE
Utilizzati ceppi infettivi e non infettivi di
Streptococcus pneumoniae,
agente della polmonite nell'uomo - letale nei i topi

Ceppi Batterici Utilizzati

Non virulento
R (rough)

III S
O
IIR
0
Virulento con
rivestimento o
capsula
polisaccaridic:
S (smooth)

Batteri di tipo S
Batteri di tipo R
Batteri di tipo S
Batteri di tipo R vivi
Batteri di tipo S uccisi
vivi
vivi
uccisi col calore
vivi e uccisi

Colonie di batteri
di tipo S
Colonie di batteri
di tipo R
Nessuna colonia
Colonie di batteri
di tipo S
0

Risultati dell'Esperimento di Griffith

323/09/2020
Dai cadaveri dei topi morti vennero recuperate cellule
batteriche vive che formavano colonie di tipo liscio e
che in una successiva infezione risultavano virulente
Un costituente cellulare: PRINCIPIO TRASFORMANTE era passato dalle
cellule S uccise dal calore a quelle del ceppo R vive, determinando la
trasformazione delle cellule batteriche R in S

Trasformazione Batterica: Avery, McLeod e Mccarthy (1944)

Il Principio Trasformante è il DNA

TRASFORMAZIONE BATTERICA
Avery, McLeod e Mccarthy (1944)
Il 'principio trasformante' è il DNA

Estratto di cellule
del ceppo S
Nessuna sostanza
distrutta
Si distruggono
i polisaccaridi
Si distruggono
i lipidi
Si distrugge
I'RNA
Si distruggono
le proteine
Si distrugge
il DNA

Ceppo R
I topo muore
Il topo muore
Il topo muore
Il topo muore
Il topo muore
Il topo vive
Nessun ceppo S raccolt
Si raccolgono cellule
del ceppo S vive

Conferma del DNA come Agente Trasformante

423/09/2020
Con questo esperimento, Avery e collaboratori dimostrarono
che il DNA è il fattore capace di trasformare il batterio
Streptococcus pneumoniae, dalla sua forma non patogena a
quella patogena.
Solo la DNasi, che degrada il DNA, sopprimeva anche la
capacità degli estratti di trasformare batteri non patogeni
nella corrispondente forma patogena.
Su queste basi si arrivò ad identificare
l'agente trasformante nel DNA
La comunità scientifica era però scettica, perché si pensava
che le proteine fossero il materiale genetico

Hershey e Chase (1952): Il DNA è il Materiale Genetico

Hershey e Chase (1952)
I virus possono moltiplicarsi solo se infettano una cellula e si
impadroniscono del controllo dell'apparato metabolico della
cellula infettata.
Nei loro esperimenti, Hershey e Chase utilizzarono dei
batteriofagi o fagi che sono dei virus delle cellule batteriche.
I fagi hanno una struttura molto semplice. Sono costituiti da un
involucro proteico (capside) e da una molecola di DNA racchiusa
nell'involucro.
Nei loro esperimenti, Hershey e Chase marcarono con isotopi
radioattivi il DNA o le proteine di due popolazioni diverse dei
fagi per verificare quale fosse la molecola in grado di penetrare
nei batteri e di impadronirsi del controllo cellulare.
https://www.youtube.com/watch?v=uFXuxGuT7H8
VIRUS
NON
CLASSIFICABILI
COME ESSERIVIVENTI
POICHE NON CAPACI
DIRIPRODURSI
AUTONOMAMENTE

Fagi Radioattivi: Marcatura di Proteine e Acidi Nucleici

523/09/2020
Come sono sati ottenuti fagi radioattivi
35S marca solo proteine
32P marca solo acidi nucleici
Moltiplicazione del batterio E. coli in presenza di radioisotopi

E. coli
E. coli
step 1
Terreno di coltura con 35s
RADIOATTIVO
Terreno di coltura con 3.2p
-
Infezione dei batteri radioattivi con i fagi
Fago T2
s - proteine
step 2
29 - acidi nucleici

Esperimento di Hershey e Chase: Metodologia e Risultati

ESPERIMENTO: Hershey e Chase condussero un esperimento conclusivo per dimostrare se il materiale genetico fosse il DNA o le
proteine. Utilizzarono il fago T2 per il loro esperimento; esso è formato solo da DNA e proteine.
1. Essi infettarono E. coli cre-
sciuti in presenza di "Po "'S
con il fago T2. La progenie
fagica aveva il DNA mar-
cato con "P o le proteine
con MS.
2. Nuove cellule di E. coli
erano infettate con i fagi
marcati radioattivamente.
3. Dopo aver infettato i bat-
teri, le cellule erano mesco-
late in un frullatore al fine di
rimuovere gli involucri fa-
gici dalla superficie cellulare.
I componenti erano ana-
lizzati per la radioattività.
4. La progenie fagica
veniva analizzata
per la radioattività.
Involucro fagico
privo del DNA-
Proteine marcate
con 355
E. coli
Progenie fagica ottenuta
da E. coli cresciuti in 35S
RISULTATO: Nessuna radio-
attività all'interno delle cellule:
"'S nel rivestimento fagico
RISULTATO: Nessuna
radioattività nella pro-
genie fagica.
DNA marcato
con 32p
Involucro fagico
privo del DNA
E. coli
Progenie fagica ottenuta
da E. coli cresciuti in 32p
RISULTATO: P all'interno
della cellula; non nell'involuc
fagico
RISULTATO: "P nella
progenie fagica.
Anche nei virus il materiale ereditario è rappresentato dal DNA e non dalle proteine !!

Watson & Crick (1953): La Doppia Elica del DNA

623/09/2020
Watson & Crick (1953)
Il DNA è una molecola a doppia elica

Pubblicazione Originale di Watson e Crick

Figura riportata nella
pubblicazione originale
di Watson e Crick
Nature, Aprile 1953
James Watson
Francis Crick
This figure is purely
diagrammatic. The two
ribbons symbolize the
two phosphate-sugar
chains, and the hori-
zontal rods the pairs of
bases holding the chains
together. The vertical
line marks the fibre axis

Struttura del DNA: Catena di Nucleotidi

Struttura del DNA
catena di nucleoidi
5'
3'
c(
G
- zucchero
T<
A
+ gruppo
fosforico
G
C
G
C
basi azotate
DOPPIO ANGULO
A
>T
A = adenina
G = guanina
A
purine
C(
G
3'
C = citosina
T= timina
pirimidine
5'
ANGLO
SINGOLO

Struttura di un Nucleotide

723/09/2020
Struttura di un nucleotide

HO
H
O
H
H
OH
OH H
deossiribosio
H-C
-
N-
pirimidine
Thymine (T)
0
HN
0-CH;
O=C
0
HO-P-O-CH
HO
P-O-CH
0
OH H
OH
H
La quantità d'
La quantità di
T
Guanine (G)
Ğ
C
N
CH
HIN-C
CH
0
HO-
O-CH, O
HO-P-O-CH2
0
OH H
OH H

Nomenclatura di Basi, Nucleosidi e Nucleotidi

NOMENCLATURA
BASE
NUCLEOSIDE
ABBR.
BASE + ZUCCHERO =
NUCLEOSIDE
base
adenina
adenosina
A
guanina
guanosina
G
base
sugar
citosina
citidina
C
uracile
uridina
U
timina
timidina
T
BASE + ZUCCHERO + FOSFATO =
NUCLEOTIDE
H
H
N
legame fosfodiestere
N
N
0
2'-deoxyribose
A
5
0
0-P-OH
:OH
H
base
ZAH
I
legame glicosidico
HC
H
phosphoric acid
H
H
H,O
N
N
O
A
O
N
N
H
H
H
-H
-O
HC
H
nucleotide (dAMP)
(deossi-ribonucleoside 5'-fosfato)
NH2
-
N~
Z
purine
0
Nitrogenous
base
Adenine (A)
NH
O-P-O-CH2 O.
=0
H
H
H
Phosphate
group
OH H
Sugar
L=0
NH
Cytosine (C)
Purine
(A +G)
Primidine
(T +C)
O=C-
D-L=D
N
HOCH
N
O-P-OCH
NEC-H

Terminazioni 5' e 3' del DNA

823/09/2020
DOVE FINISCE
5 LIBERO
Terminazione 5'
O
Fosfato
5
- 0
5'CH,
Base
H
H
H
13
0
H
1
HO-P=0
N
NH
H
NH2
I
0
0
CH3 Timina (T)
O
H
5 CH2
NH
C
0
H
Pirimidine
(struttura
ad anello
singolo)
0
H
Citosina (C)
NH2
H
S'CH
2
O
OH
T
Gruppo ossidrile
Terminazione 3'

Modello della Struttura ad Elica del DNA

Modello della struttura ad elica del DNA
Direzioni opposte: 2 catene
antiparallele
Scheletro
/ zucchero-fosfato
Una unità di nucleoside
moncfosfato
5'
GHIIC
3
5'
CHIG
O -- H-N
1
6' CH
0
T
A
0
3
4
2
Coppia di basi
CH2
1
0
CHIG
0
O --- H-N
ATTIT
G
3
3'
GHIC
CH2
Legame
fosfodiesterico-
O=P
CH2
At !!
-H-N
CH
CHIG
C
OSP
AHIT
C N --- H-N G
O --- H-N
O
AHMET
CH2
3
GHIO
(a)
5'
Legami idrogeno
9
V3'
DOVEINIZA
3' LIBERO
O
Desossiribosio
(zucchero a 5 atomi di carbonio)
O
HC-N Adenina (A)
O.
5'CH
NH2
1
2
N
H
0
Purine
(struttura a
due anelli)
HCN Guanina (G)
S'CH2
O
0
5' CH 2
Base
H
H
H
13'
OH
H
3
6
N-H --- O
CH2
IT
CH
C
1
NIH
-023/09/2020

Legami Idrogeno A-T, C-G

Coppia di Basi Adenina-Timina

a) Coppia di basi adenina-timina
(doppio legame idrogeno)
Timina
Adenina
H
1
CH
O ... H-N
N
C
C
G
C
H-C
N
N
C
C=N
Desossiribosio
O
H
Desossiribosio

Coppia di Basi Guanina-Citosina

Tratti di
DNA C-G
sono piu'
stabili dei
tratti A-T
b) Coppia di basi guanina-citosina
(triplo legame idrogeno)
Citosina
Guanina
H
H
H
N-H ... O
N
C
C
C
C
C
H-C
N ·· · H-N
C-N
N
-C
C=N
Desossiribosio
O ··· H-N
Desossiribosio
H
Per conservare la stessa distanza tra le 2 eliche una
purina (A e G - doppio anello) è sempre associata ad una
pirimidina (C e T - singolo anello)
Pirimidina + pirimidina:
DNA troppo sottile
1
1
Purina + purina:
DNA troppo spesso
I
Purina + pirimidina: spessore
compatibile con i dati
di diffrazione ai raggi X
10
H
-H ... N23/09/2020

Caratteristiche Strutturali della Doppia Elica

Scheletro
/ zucchero-fosfato
GIBIC
CHIG
Coppia di basi
CHIG
AFFET
GHIC
Un giro
completo
dell'elica (360º)
avviene ogni 10
basi e richiede
3,4 nm
La distanza tra
coppie di basi
è 0,34 nm
(1 miliardesimo di metro)
A ::: 1
1
CHIG
AHIT
ATIET
GHIO
(a)
Ciascuna catena ha una estremità 3' e una estremità 5'.
Le due catene della doppia elica sono disposte in modo
antiparallelo in quanto i legami fosfo-diesterici che uniscono
i pentosi contigui hanno polarità opposte. In altre parole, in
corrispondenza di ciascuna delle due estremità della doppia elica,
il terminale 5' di una catena si confronta con il terminale 3' della
altra catena.
Le due eliche differiscono quindi per polarità, per sequenza e
per composizione in basi, ma sono perfettamente complementari,
cioè la sequenza di una catena è completamente determinata da
quella della catena opposta

Conformazioni del DNA

1123/09/2020
Conformazioni del DNA
IL modello della doppia elica di Watson-Crick è in realtà una
semplificazione.
Le conformazioni ad elica del DNA vengono attualmente
classificate in tre famiglie generali:
forme A, B e Z.

Tipi di Doppia Elica

(a)
(b)
(c)
ONKO GARLAND PUBLISHING INC
Gli acidi nucleici possono formare
vari tipi di doppia elica

• Modello Watson e Crick
• Idratato, presente di norma nelle cellule
  DNA-B
• Basi azotate perpendicolari rispetto all'asse
  dell'elica
• Elica destrorsa
• In situazione di disidratazione
  DNA-A
• Base azotate inclinate rispetto all'asse dell'elica
• Elica destrorsa
• Andamento a zig-zag dell'elica
  DNA-Z
• Ricco di coppie G-C
• Elica sinistrorsa
• Ruolo poco chiaro
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