Appunti di Microbiologia: Microrganismi, Diagnostica e Metabolismo Batterico

Microbiologia: Studio dei Microrganismi

MICROBIOLOGIA: Cosa studia? La Microbiologia è lo studio dei microrganismi, Cioè, tutti gli esseri Unicellulari. La maggior parte sono Procarioti, ma in alcuni casi (Protozoi, Miceti Microscopici) sono eucarioti unicellulari. Si riscontrerà come virus e batteri possano generare delle patologie definite "malattie da infezione". I Microrganismi si differiscono per varie caratteristiche tra di loro.

• I Microrganismi Procarioti, possiedono la più semplice organizzazione cellulare, caratterizzata da un distinto compartimento nucleare, o da altri organelli intracellulari.

L'albero Filogenetico universale degli esseri viventi, si divide in tre famiglie: Archea, Bacteria (Entrambi Unicellulari) e Eukarya (Organismi più complessi cioè Eucarioti o Protisti).

Tampone Molecolare e Antigenico

Tampone Molecolare

TAMPONE MOLECOLARE: Serve a ricerca il materiale genetico del virus. È stato usato molto durante il covid (il virus sars è un virus a RNA ).

Tampone Antigenico

IL TAMPONE ANTIGENICO: Con il quale andiamo a ricercare degli antigeni. Sempre nel caso del sars-covid-2 possono essere le proteine che formano l'envelope (PROTEINE SPYKE).

Proteine Spike

LE PROTEINE SPYKE: Sono presenti sia nei virus vestiti di envelope che quelli nudi: Nei virus nudi si trova sul capside, mentre in quelli vestiti si trova nell'envelope. C'è maggiore possibilità che si trovi su quelli vestiti. Questa proteina si lega ai recettori della cellula ospite, permettendo al virus di entrare in essa.

Reazioni Sierologiche

REAZIONI SIEROLOGICHE:

• Se il siero di un animale (vertebrato) immune nei confronti di un determinato antigene viene mescolato in vitro con l'anticorpo corrispondente, gli anticorpi presenti nel siero reagiscono con l'antigene dando luogo ad un immunocomplesso.

• IMMUNOCOMPLESSO: è una molecola formata dal legame di più antigeni ed anticorpi.

• In microbiologia lo studio della formazione dell'immunocomplesso può essere utilizzato a scopo diagnostico mediante diverse reazioni sierologiche.

Una reazione sierologica è una reazione che consente, mettendo a contatto un siero immune o presunto tale con un determinato antigene, di verificare direttamente o indirettamente l'avvenuta formazione dell'immunocomplesso. Ci sono due reagenti fondamentali in ogni reazione sierologica:

• Siero: con contenuto anticorpale noto o presunto;
• Antigene. Di questi due reagenti, uno dei due deve essere sempre noto. Questo vuol dire che le reazioni sierologiche sono ambivalenti. Ovvero consentono:
• Disponendo di un antigene noto di dimostrare in un siero la presenza di anticorpi per quel determinato antigene;
• Disponendo di un siero contenente un anticorpo noto, di dimostrare in un dato materiale la presenza dell'antigene corrispondente.

Quando si Eseguono le Reazioni Sierologiche

QUANDO SI ESEGUONO LE REAZIONI SIEROLOGICHE?

• Le reazioni sierologiche si eseguono quando si vuole ricercare la presenza di anticorpi nel siero di un paziente per dimostrare la presenza di una malattia infettiva.
• O quando si vuole identificare un microrganismo in base agli antigeni che possiede.

Tipi di Reazioni Sierologiche

Le reazioni sierologiche possono essere di diversi tipi:

• Agglutinazione: quando l'antigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri);
• Precipitazione: quando l'antigene è solubile.
• Neutralizzazione: quando l'antigene per azione del suo anticorpo perde le sue attività;
• Lisi: quando l'antigene è corpuscolato e la reazione avviene in presenza di un complemento, Questo processo può essere utilizzato per identificare specifici antigeni o per valutare la risposta immunitaria.

Reazione di Precipitazione

REAZIONE DI PRECIPITAZIONE: E' una reazione sierologica in cui un siero immune o presunto tale viene cimentato ad un antigene macromolecolare solubile e nella formazione dell'immunocomplesso potremmo notare la formazione di un precipitato insolubile visibile. Non viene applicato molto nella diagnostica di malattie infettive, Bensì è più spesso usato nell'identificazione di antigeni in medicina legale (per identificare la presenza di sangue o sperma) o nel settore alimentare per identificare antigeni nelle carni essiccate).

Reazione di Agglutinazione

REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE: E' una reazione sierologica in cui un siero immune o presunto tale viene cimentato ad un antigene corpuscolato e la formazione dell'immunocomplesso si evidenzia con l'agglutinazione dell'antigane in ammassi voluminosi. Questa reazione necessita della presenza di elettroliti per neutralizzare le cariche negative sulla superficie batterica, e Viene favorita dall'agitazione e dal riscaldamento a 37 C°, che aumentano la probabilità e la velocità di collisione delle particelle antigene. Viene usata per identificare anticorpi batterici (salmonella, brucellosi etc) nel siero di pazienti sospetti di infezione. Viene spesso usata anche per l'identificazione di antigeni (batteri) con il metodo di un vetrino portaoggetti sul quale si mescola una goccia di siero con anticorpo noto e una goccia di sospensione di antigene (cioè gli antigeni sono dispersi in un liquido) , aspettando di vedere poi l'avvenuta agglutinazione ad occhio nudo o piccolo ingrandimento di quest'ultimo "mescuglio". La reazione di agglutinazione in provetta è leggibile dopo circa 18-24h di incubazione a 38 C°, mentre quella di vitro dopo pochi minuti dal suo allestimento.

Reazione di Neutralizzazione

REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE: E' una reazione sierologica in cui un siero immune o presunto tale, viene cimentato ad un antigene che presenta un'attività sierologica specifica e la formazione dell'immunocomplesso è evidenziata con la perdita da parte dell'antigene di questa attività. La formazione dell'immunocomplesso non è evidente, ma bisogna ricercare in appositi substrati se l'attività biologica dell'antigene sia cessata a contatto con il siero.

Vi sono reazioni sierologiche che impiegano anticorpi o antigeni legati ad un tracciante che è in grado di emettere segnali che consentono di dimostrare l'avvenuta formazione dell'immunocomplesso. Tra questi ci sono i test di Elisa:

Metodo Diretto ELISA

METODO DIRETTI con cui si determina la presenza dell'antigene.

1. Il metodo prevede di riempire il fondo del pozzetto (che è una cavità presente su una piastra in laboratorio) con l'anticorpo specifico per l'antigene che si vuole misurare;
2. Si effettua un lavaggio con tampone sierologico;
3. Si introduce l'antigene che si legherà all'anticorpo;
4. Si effettua un altro lavaggio per togliere gli antigeni in eccesso.
5. Si introduce poi un anticorpo specifico che si legherà al complesso anticorpo + antigene, formando così un triplo strato da cui prende il nome il test (elisa);
6. All'ultimo anticorpo aggiunto era legato un enzima specifico e aggiungendo il suo substrato su formerà un prodotto colorato che evidenzierà il pozzetto.

Metodo Indiretto ELISA

METODO INDIRETTO: con cui viene dimostrata la presenza di anticorpi contro l'antigene.

1. Il metodo prevede di coprire il fondo del pozzetto con l'antigene specifico per l'anticorpo che si vuole misurare;
2. Si effettua un lavaggio (con tampone sierologico);
3. Si immette il siero (campione) che si crede contenga gli anticorpi per quell'antigene;
4. Si esegue un altro lavaggio;
5. Si aggiunge un secondo tipo di anticorpo (marcato con enzima) che si legherà al complesso antigene + anticorpo (del campione) , il secondo anticorpo è un anti-anticorpo (cioè agisce da anticorpo sugli anticorpi stessi);
6. Si effettua un ulteriore lavaggio;
7. Infine si aggiunge un substrato contenente un enzima con cui è stato marcato l'anti- anticorpo, un cambiamento di colore indicherà la presenza di anticorpi nel siero (nel campione).

Il test ELISA è una tecnica di laboratorio che viene utilizzata con lo scopo di rilevare e quantificare la presenza di anticorpi o antigeni nel siero di un individuo.

Emocolture

EMOCOLTURE: Per emocoltura si intende la coltura di un campione di sangue ottenuto in sterilità e tramite puntura venosa, con lo scopo di ricercare microrganismi come batteri o funghi nel sangue (viene utilizzato a scopo diagnostico quando si sospetta un'infezione del sangue).

Come viene Effettuata l'Emocoltura

COME VIENE EFFETTUATA?

1. Bisogna prelevare il sangue. Il campione di sangue deve essere ovviamente prelevato da un singolo prelievo sanguigno, di solito il prelievo si effettua sul braccio del paziente.
2. Il campione di sangue viene inserito in due flaconi, uno aerobio (i batteri richiedono ossigeno per crescere) e uno anaerobio (i batteri non richiedono ossigeno per crescere). Si può utilizzare anche un terzo flacone per i Miceti (funghi). questi flaconi conterranno circa 8-10 millilitri di sangue in ciascuno, e conterranno sostanze adatte alla crescita dei microrganismi. Durante l'incubazione, eventuali microrganismi presenti nel sangue iniziano a moltiplicarsi e a formare colonie visibili. Il volume di sangue è la variabile più importante perchè la possibilità di far crescere un batterio dipende dalla quantità di esso inoculato nel terreno. PS: Il prelievo andrebbe effettuato prima del picco febbrile, ma per la difficoltà della sua previsione la si può effettuare anche durante le fasi febbrili. Se invece il prelievo viene effettuato dopo il picco febbrile, aumenta ancora di più il rischio di falsi negativi. I prelievi vanno portati subito in laboratorio se possibile senza essere refrigerati e in caso di ritardo o impossibilità di portare immediatamente i prelievi in laboratorio, bisogna avvisare il laboratorio e conservare il prelievo in un incubatore-termostato ad una temperatura di 35-37 C° oppure a temperatura ambiente.
3. Infine, Dopo un periodo di incubazione, si osservano le colonie che si sono sviluppate nei flaconi. Se sono presenti batteri o funghi, verranno identificati e testati per la loro sensibilità agli antibiotici.

Vengono lasciati in incubazione in appositi sistemi automatici a monitoraggio continuo a 37 Cº i Batteri (sia aerobi che anaerobi) e da 30-35 C° i Miceti. Dopodichè si potrà vedere se il campione sarà negativo o positivo.

• L'emocoltura positiva indica la presenza nel sangue di un agente infettivo. Questo può essere dovuto a un'infezione invasiva. la terapia viene poi adattata in base all'identificazione del microrganismo responsabile.
• Mentre un'emocoltura negativa risulterà priva di microrganismi nei flaconi di coltura, In altre parole, non sono stati rilevati agenti infettivi nel sangue del paziente durante il periodo di incubazione.

Urinocoltura

URINOCOLTURA: L'Urinocoltura è un esame che prevede di valutare la presenza o meno di microrganismi nelle urine, ha lo scopo di diagnosticare infezioni delle vie urinarie. Per il prelievo dell'urina si utilizza un contenitore sterile, monouso e dotato di chiusura. E' più opportuno effettuare il prelievo di mattina appena svegli, poichè la stasi notturna favorisce la concentrazione degli elementi presenti nelle urine. Il prelievo deve sempre anticipare il trattamento antibiotico e deve essere subito portato in laboratorio (entro 1h per evitare la moltiplicazione batterica), in caso di ritardo o impossibilità di portare entro 1h il prelievo in laboratorio, bisognerà conservare l'urina a 2-6 C° per un massimo di 6 ore. Si distinguono tre fasi:

1. Pre-Analitica, che prevede il prelievo e il trasporto;
2. Analitica, prevede la valutazione della concentrazione di microrganismi, attraverso la conta della carica batterica dopo 24h di incubazione.
3. Post-Analitica, che prevede la comunicazione dei risultati.

Ricordiamo che l'urina secreta dai reni è sterile ma poi subirà una contaminazione durante il passaggio nell'uretere, per questo motivo anche se nelle urine non è presente una vera e propria infezione, si possono riscontrare un certo numero di microrganismi. Ma si avrà una vera e propria infezione in corso nel momento in cui si riscontrerà una carica batterica superiore a 105 colonie. Una volta accertato l'esito positivo della determinazione della carica batterica, si effettuerà l'isolamento e l'identificazione del microrganismo responsabile dell'infezione e l'antibiogramma, con quest'ultimo si potrà trovare l'antibiotico adatto.

Coprocoltura

COPROCOLTURA: La coprocoltura è un esame microbiologico dove si ricercano batteri come salmonella e shigella, viene svolto su un campione di feci, ed è utilizzato per la diagnosi di alcune patologie del tratto gastrointestinale. Il campione di feci deve comprendere eventuali presenze di sangue o muco.