Procesamiento Citológico y Tisular: técnicas de corte y montaje de muestras

PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE CORTE

ÍNDICE · INTRODUCCIÓN . TIPOS DE MICROTOMOS Y COMPONENTES · RETALLADO DEL BLOQUE DE PARAFINA · PREPARACIÓN DEL EQUIPO: ORIENTACIÓN DEL BLOQUE Y LA CUCHILLA · DESBASTACIÓN DEL BLOQUE DE PARAFINA · PROBLEMAS EN LA SELECCIÓN DE ESPECÍMENES Y RESOLUCIÓN · EXTENSIÓN Y MONTAJE DE LAS MUESTRAS · CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS DE SEGURIDAD

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Registro y conservación de las muestras

Descripción macroscópica

Tallado de las muestras

Fijación tisular

Inclusión

CORTE

Producción de artefactos

INTRODUCCIÓN AL MICROTOMO

El microtomo es un instrumento mecánico de precisión con el que se realizan cortes de tejido de grosor micrométrico para su estudio al microscopio La elección del tipo de microtomo está determinada:

Preparación del tejido: · Fresco o fijado · Incluido o no

Método de tinción que se vaya a emplear

Idoneidad del resultado: · Tiempo dedicado · Presupuesto disponible · Resolución necesaria

Instrumento disponible en el laboratorio: · Según el grupo de investigación

COMPONENTES DE UN MICROTOMO

Todos los microtomos no manuales presentan los mismos componentes básicos:

• Portabloques > Plataforma o pinzas en la que se coloca el casette o bloque con el material tisular a cortar. Suele presentar un sistema de orientación con el que regular la la posición y /o inclinación entre el bloque y la cuchilla (Imagen A)
• Portacuchillas > Sistema de fijación que sujeta y orienta la cuchilla. Es posible variar el ángulo de inclinación (Imagen B)
• Mecanismo de avance -> Mecanismo mecánico o electrónico que determina la distancia que avanza el portabloques hacia la cuchilla o al revés, regula el grosor de los cortes
• Freno o sistema de bloqueo > Permite asegurar el movimiento de la cuchilla o la manivela

A Thermo H 1 B

TIPOS DE MICROTOMOS

Tipo de instrumento

Procesamiento de la muestra

Grosor de la sección

Cuchilla

Cortes

Microtomo de cuchilla vibrante

Frescas o fijadas sin incluir

Delgadas y gruesas

Móvil

Individuales

Microtomo de rotación o Minot

Fijadas e incluidas en ceras tipo parafina

Semifinas y delgadas

Fija

Individuales o seriados

Microtomo de deslizamiento

Frescas o fijadas sin incluir

Gruesas

Móvil

Individuales

Microtomo de congelación

Frescas o fijadas sin incluir

Delgadas y gruesas

Móvil

Individuales

Criostato o criotomo

Frescas o fijadas incluidas en OCT (del inglés, compues- to de temperatura de corte óptima)

Delgadas

Fija

Individuales

Ultramicrotomo

Fijadas incluidas en resinas

Ultrafinas y semifinas

Fija

Individuales

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MICROTOMO DE MANO

El microtomo de mano, de Ranvier o de Bresser (versión actualizada con pinza interior) permite realizar cortes de 10 um a 500 um

• Estructura cilíndrica hueca coronada con una platina de vidrio con un espacio en el medio
• Al girar el tornillo micrométrico, la muestra se eleva de forma gradual y sobresale una parte de la misma
• Los cortes se obtienen desplazando la cuchilla humedecida sobre la platina de vidrio y las secciones se recogen en una placa de Petri
• Se obtienen cortes gruesos y poco regulares
• Generalmente en desuso, se utiliza todavía: · Secciones de prueba de tejidos frescos · Campos de la botánica y la fisiología vegetal

Muestra

Pinza de presión interior

Navaja de barbero

Platina de vidrio

Estructura de acero inoxidable

45 10 Tornillo micrométrico para avance 0 5 Placa Petri

MICROTOMO DE OSCILACIÓN

El microtomo de cuchilla vibrante o vibratomo es un instrumentos que aplica vibración a una cuchilla desechable de un solo filo que avanza de forma horizontal hacia la muestra

• Muestras frescas o fijadas sin incluir que se pegan a un portamuestras con pegamento de contacto
• La muestra unida al portamuestras se situa sobre una plataforma elevadora
• No permite obtener secciones seriadas -> Sistema semiautomático
• Los cortes que quedan en la cubeta de flotación se recogen de uno en uno con la ayuda de un pincel y se depositan en una placa de Petri
• Los vibratomos son sistemas baratos y simples
• Son un buen recurso cuando se quieren obtener resultados rápidos (no inclusión o congelación), evitar la deshidratación de los procesos de inclusión o para obtener cortes más gruesos

https://youtu.be/tblDpfdTsW8?si=O-RR-54c3BHqYZeg

Muestra

Pegamento de contacto

Bloque portamuestras

Movimiento vibratorio

Movimiento avance-retroceso

Cuchilla

Cortes en flotación

Muestra

Tampón de trabajo

Plataforma elevadora

MICROTOMO DE ROTACIÓN

MICROTOMO DE ROTACIÓN O MINOT

El microtomo de rotación, de parafina o tipo Minot es el sistema más utilizado en microtomía

• Permite el corte automático de secciones delgadas (2-50 um) seriadas de bloques de muestra fijada e incluida en parafina
• La cuchilla se coloca de manera horizontal con el filo hacia arriba en un portacuchillas fijo
• El bloque de inclusión, contenido en un casette, se coloca en una pinza portabloques universal móvil que lo inmoviliza
• El bloque avanza hacia la cuchilla al manipular una manivela lateral mediante un movimiento circular

Interruptor de emergencia

Pantalla y panel principal para selección de espesor de corte

Sistema de bloqueo

Tornillo de ajuste del bloque de muestra

Manivela manual

Pinza universal para cassettes

18802

Tornillo de ajuste para la orientación en dirección del corte

18808

Baño de flotación

Panel secundario

Protector de dedos

Portacuchillas para cuchillas desechables

Bandeja extraíble para residuos

Botón de encendido/ apagado

Indicador luminoso de calentamiento

Figura 4.3 Microtomo de rotación.

Termostato analógico

MICROTOMO DE ROTACIÓN: FUNCIONAMIENTO

El microtomo de rotación, de parafina o tipo Minot es el sistema más utilizado en microtomía

• El bloque se mueve de arriba hacia abajo y avanza la distancia introducida para obtener el grosor del corte
• Al estar fija la cuchilla, no vibra y se favorece la estabilidad del corte
• Las secciones seriadas se recogen con ayuda de un pincel extendidas en un baño de flotación con agua atemperada (40-45℃) que permite el moldeamiento de los cortes

https://youtu.be/VJT3ov80EpU?si=LqSGv NR7yvpQo8Ru

Interruptor de emergencia

Pantalla y panel principal para selección de espesor de corte

Sistema de bloqueo

Tornillo de ajuste del bloque de muestra

Manivela manual

Pinza universal para cassettes

18802

Tornillo de ajuste para la orientación en dirección del corte

18808

Baño de flotación

Panel secundario

Protector de dedos

Portacuchillas para cuchillas desechables

Bandeja extraíble para residuos

Botón de encendido/ apagado

Indicador luminoso de calentamiento

Figura 4.3 Microtomo de rotación.

Termostato analógico

MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO

El microtomo de deslizamiento o de trineo es el segundo metodo mas común para hacer cortes de tejido para microscopia óptica

• Permite el corte semiautomático de secciones mediante una cuchilla móvil que se desliza hacia delante y atrás
• Así se corta la muestra, situada sobre un portabloques fijo
• Las secciones resultantes son recogidas en una Placa de Petri con solución tamponada
• Son útiles para cortar bloques grandes, bloques de celoidina o preparaciones enteras de gran tamaño
• Cuanto mayor sea la muestra, mayor grosor deben tener las secciones
• La movilidad de la cuchilla puede hacer que ésta vibre y que los cortes sean de peor calidad

Leica LEICA SM 2010R

MICROTOMO DE CONGELACIÓN

El microtomo de congelación es un microtomo de deslizamiento acoplado a un sistema de enfriado, en el que un tubo de plástico conecta la base metálica del portamuestras con un sistema de refrigeración externo, enfriando la muestra a temperaturas inferiores a -20℃ por contacto directo con la plataforma refrigerada

• La temperatura se mantiene constante y al dar rigidez a la muestra las secciones se puede hacer más finas
• Una vez cortadas, se recogen de la cuchilla y se añaden a un recipiente con solución tampón
• Este instrumento se utiliza cuando se quiere evitar la deshidratación de los procesos de inclusión

https://www.youtube.com/watch?v=q4PVuv TNI04&t=213s

Tubo conector con el sistema de refrigeración

Portacuchillas para cuchillas desechables

Sistema de refrigeración

Soporte sobre el que se coloca el bloque

Sistema de bloqueo

Tornillo de ajuste para la orientación en dirección del corte

Manivela de avance macro

Palanca de sujeción de la orientación de la muestra

Palanca de aproximación manual

Indicador de enfriamiento

Botón giratorio para la selección del espesor del corte

botón de Encendido/ Apagado

CRIOTOMO O CRIOSTATO

El criotomo es un microtomo de rotación similar al de parafina metido dentro de una camara de congelación (-14 y -20℃) que puede generar cortes de hasta 2 um

• Se utiliza para cortar muestras de tejido fresco mantenidas en congelación desde la extracción o fijadas y conservadas en un tampon de criopreservación
• La manivela de rotación se encuentra en el exterior, mientras que el portabloques, el portacuchillas y el mecanismo de avance están en el interior
• Es aconsejable tener otra cuchilla afilada en el interior de la cámara por si la utilizada no funcionase bien
• Los cortes se montan uno a uno directamente sobre el portaobjetos

Microtomo de rotación

Superficie de enfriamiento rápido

Placa anti-roll

Panel principal

Bandeja de residuos

Panel secundario

ventilador desempañador automático (una vez se cierra la ventana)

Cámara refrigerada

Manivela manual

LEICA CM1529

ULTRAMICROTOMO

Los ultramicrotomos se utilizan para producir secciones de tejido ultrafinas (10-80 nm) incluidas en resinas para examinarlas bajo el microscopio electrónico

• El mecanismo es igual que en el microtomo de rotación, la cuchilla es fija y lo que se mueve es la muestra
• Es capaz de hacer avanzar la muestra a incrementos muy pequeños (nm)
• Presenta gran estabilidad durante el corte, eliminando las vibraciones
• La cuchilla suele ser de vidrio o diamante
• Las secciones se recogen en una balsa con agua integrada a la cuchilla y posteriormente se colocan en una malla de cobre o níquel
• El equipo se localiza en una habitación especial con control de temperatura y ausencia de vibraciones

https://tv.ujaen.es/video/5cbe1c2e8f42088c1d8b45d7

C Secciones

Bloque con muestra

Rejilla

- Secciones flotando en la 1 balsa de Pinzas aqua

Oculares

Lupa estereoscópica

Enfoque

Protector de polvo

Brazo del micrótomo para espécimen

Soporte portacuchillas

ULTRAMICROTOMO

Cuchilla de vidrio

Cuchilla de diamante