Tecnología del ADN recombinante e ingeniería genética de Unsch

Biotecnología y Tecnología del ADN Recombinante

HVA VIVERE
PRIMY
DEINDE PHILOSOPHARE
ancheChristoph
+
OS
BIOTECNOLOGÍA
BT-387 (5)
ESPECIAL
DAD
DE
BIOLOGI
IOTECNOLOGIA
E. P.
UNSCH
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Mg. Paula García Godos Alcázar

Ingeniería Genética

1Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA
INGENIERÍA GENÉTICA
V
Conjunto de técnicas que permite transferir genes
de un organismo a otro y expresarlos en
organismos diferentes al de origen.
1
Las técnicas que emplea la IG se denominan
técnicas de ADN recombinante.
1
Es posible obtener proteínas recombinantes de
interés, organismos transgénicos para mejorar
cultivos y animales, producir fármacos, y obtener
proteínas que utilizan diferentes industrias en
sus procesos de elaboración.
OH
V
HN
HO
10
7403.980-08
2.318-07
7:402.510-08
A.001.00€-08
1,00€-06
H.403.986-09
2.516:06
HN
8.501.5.82-09
HO
9.001.006-09
9.AGA BEE-19
0.801.586-10
OCH
10.206-31E-FF
10.403 900:11
6.03
10.002-SIE-11
10 801/385-1
1.00E =1
H.CO
2
-11
9
8
7
LOCHBIOTENOLOGÍA

Clonación Molecular

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
CLONACIÓN MOLECULAR
purificación
El desarrollo de la tecnología de ADN
recombinante y la clonación molecular nos
permite el aislamiento,
replicación de fragmentos específicos de
ADN.
y
Clonación y expresión
1. Incorporación del gen de interés en el vector
Promotor
Enzima de
restricción
DNA
ligasa
DNA linker
Plásmidos
2. Vector transferi do
a la célula huésped
Gen
Proteína de interés
3. Clonación/expresión
de la proteína
El procedimiento de clonación
molecular implica dos etapas:
◼
Creación
del
ADN
recombinante
◼
Introducción del ADN en una
célula hospedadora donde se
replicará (amplificación).
3BIOTENOLOGÍA

Tipos de Clonación

Clonación Artificial y Natural

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
CLONACIÓN
Un clon es una copia genética idéntica de otro individuo,
sea unicelular o pluricelular.
Puede ser
ARTICIAL: Clonación terapéutica y
clonación reporductiva.
NATURAL: Fisión binaria en bacterias y
protistas, propagación vegetal , generación
de gemelos idénticos.

Clonación Terapéutica

Clonación terapéutica
Terapia in vivo
Terapia ex vivo
Células madre genéticamente
modificadas (puede bloquear el
rechazo inmunológico del paciente)
Gen terapéutico
OR
Gen terapéutico
ES cell
HLA bank
El gen terapeutico se
empaqueta en un
vector, como un
retrovirus
OR
SCNT
Células madre
diferenciadas
In vitro
Las células madre son aisladas y
se multiplican en el laboratorio
El gen terapeutico se
empaqueta en un
vector, como un
retrovirus y se
introduce en las
células
Células madre
adultas
Es inyectado en
el paciente
Órgano diana
p.e. higado
Las células genéticamente
modificadas se reintroducen
en el paciente

Clonación Reproductiva

Clonación reproductiva
Donante
Proceso de clonación de Dolly
Hembra
portadora
extracción del
nucleo del óvulo
célula
especializada
implantación del nucleo
de una célula donante
Dolly
implantación
del embrión en
la hembra
portadora
copyright marta cerezo
4BIOTENOLOGÍA

Diferencias entre Ingeniería Genética y ADN Recombinante

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
DIFERENCIAS ENTRE INGENIERÍA
GENÉTICA Y ADN RECOMBINANTE
La ingeniería genética
es un término amplio
que se refiere
al
proceso que se utiliza
para
manipular
la
estructura genética de
un organismo.
La tecnología de ADN
recombinante es la
técnica utilizada para
crear una molécula de
ADN recombinante con
ADN de dos especies
diferentes.
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
CORTAN EL -
GEN DE INTERÉS
PLÁSMIDO
GEN DE RESISTENCIA
A UN ANTIBIÓTICO
REGIÓN DE INTERÉS
DEL GEN
C
+ ADN LIGASA
6 todo
diagnóstico
PLÁSMIDO RECOMBINANTE
En ambos procesos se manipula el material genético de un organismo,
están interrelacionadas, y la ingeniería genética sería imposible sin el
uso de la tecnología de ADN recombinante.
5BIOTENOLOGÍA

Tipos de Clonación

Clonación Molecular y Celular

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
Tipos de Clonación
Clonación molecular
La clonación molecular se
refiere al proceso de aislar una
secuencia de ADN de interés,
insertarlo en un plásmido y
obtener múltiples copias de
ella en un organismo
(generalmente procariota) por
acción de la DNA polimerasa
Clonación celular
Clonar una célula significa
derivar una población celular
a partir de una sola célula. Ese
es un importante
procedimiento in vitro
cuando se desea la expansión
de una sola célula con ciertas
características.
https://es.slideshare.net/queste6002/la-clonacin-de-individuos
6BIOTENOLOGÍA

Tecnología del ADN Recombinante: Aplicaciones

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
La tecnología recombinante se
refiere en general a la clonación
molecular de ADN extraño en
elementos de ADN extracromo-
sómico bacteriano (es decir,
plásmidos) que pueden propa-
garse en un huésped bacteriano
como Escherichia coli
Plásmido de una bacteria
Gen de de una
célula de interés
Plásmido recombinante
Plásmido recombinante
insertado en una bacteria
La tecnología recombinan-
te ha dado como resultado
la generación de más de
140 proteínas terapéuticas
APLICACIONES
INVESTIGACIÓN
INDUSTRIA
FARMACÉUTICA
RESISTENCIA
A PESTICIDAS
BACTERIAS
USADAS PARA
REMOVER METALES
PESADOS
INDUSTRIA
ALIMENTICIA
Imágenes: Biorender.com
Maily GonzálezBIOTENOLOGÍA

Tecnología del ADN Recombinante: Estudio de Drosophila

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMBINANTE
Propiedad A de
Drosophila en estudio.
Identificación de mutantes
que carezcan de A.
Cruzamiento silvestre
x mutante
silvestre
F2
mutante
Relacionar el gen de
interés A con el alelo
mutante a.
Extracción
del DNA
de Drosophila.
Extracción del
DNA vector a
partir de bacterias.
O
Digestión del DNA.
Apertura del vector.
Construcción del DNA recombinante.
Introducción en bacterias para su clonación.
Selección del clon portador
del gen A.
Griffiths et al., 2008
8Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA

Endonucleasas de Restricción

Características y Función

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Enzimas que cortan la molécula de
ADN
en
sitios
específicos
denominados sitios de restricción.
Reconocen secuencias específicas de
4 a 8 bases (palíndrome).
Las bacterias las producen como
mecanismos de defensa frente a
fagos.
Presentan
tres propiedades que
resultan útiles:
a)
Realizan cortes en secuencias
específicas
b)
Producen cortes escalonados
(extremos cohesivos).
C)
Cortan el DNA de tamaño
adecuado para su clonación.
Enzimas de Restricción
C
AATTO
bordes pegajosos
G
Xxx
CTTAA
bordes pegajosos
9Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA

Mecanismo de Acción de Enzimas de Restricción

¿cómo actúan las enzimas de restricción?
GAAT TC
5'
3'
3'
5'
CTTAAG
5
3
3'
5'
EcoRI, restriction endonuclease
AATTC
3
5'
3'
5
3'
5'
G
CTTAA
Alul
3'
5'
. . . A G C T ... 3'
.TC G A . . . 5'
Haelll
5'
. . G G.C C .. . 3'
3'
.CCGG ..
5'
5'
.G GAT C C ... 3'
BamHI
3'
.. . CCTAGG ... 5'
5'
A A G CT T.
3'
HindIII
3'
. . TTCGAA ...
5'
EcoRI
5'
. . . G .A ATT C ... 3'
3'
. . . C TTAAG ... 5'
Alul and Haelll produce blunt ends
..
DNA
duplex
c
I
restriction
enzyme
+
T
T
050
090
030
"sticky ends"
020
A
A
T
T
pallindrome
GTAGAATTCATTCACGCA
CATCTTAAGTAAGTGCGT
restriction site
GTAG
CATCTTAA
fragment 1
+
AATTCATTCACGCA
GTAAGTGCGT
fragment 2
BamHI Hindil and EcoRI produce "sticky" ends
10
020
050
030
G
5'
3Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA

Restrictasas Comunes en Ingeniería Genética

Organismo
Designación
Secuencia
Nota
Bacillus subtilis
BsuRI
5' .. GGVCC .. 3'
3' .. CCÎGG .. 5'
Genera extremos romos
Escherichia coli
EcoRI
5' .. GVAATTC .. 3'
3' .. CTTAAÎG .. 5'
Genera extremos
cohesivos
Escherichia coli
EcoRII
5'.VCCAGG .. 3'
3' .. 1GGTCC .. 5'
No palindromica
Escherichia coli
EcoRV
5' .. GATVATC .. 3'
3' .. CTAÎTAG .. 5'
Genera extremos romos
Haemophilus
influenzae
Hindll
5' .. GTPyV PuAC .. 3'
3' .. CAPut PyTG .. 5'
Pu: cualquier purina
Py: cualquier pirimidina
Restrictasas más comunes empleadas en Ingeniería Genética
Restrictasa
Organismo de origen
Secuencia de
reconocimiento
EcoRI
E. coli
... G A A T T ...
EcoRII
E. coli
CCAGG ...
BamHI
Bacillus
amyloliquefaciens
... G GATCC ...
HindIII
Haemophilus
influenzae
.. AAGCTT ...
BsuRI
Bacillus subtilis
... GGCC ...
Fuente: Biologia de Everest
SECUENCIAS RECONOCIDAS Y SITIOS DE RESTRICCIÓN DE
DIFERENTES ENDONUCLEASS DE RESTRICCIÓN
11Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA

Vectores de Clonación

Características de los Vectores

VECTORES DE CLONACIÓN
Características:
Moléculas pequeñas y circulares, para
ser fáciles de manipular.
1
Capaces de proliferar en una célula
viva.
Permiten
la
amplificación
del
fragmento donante insertado.
Contienen
sitios
de
restricción
convenientes para la
inserción
del DNA que se desee clonar.
Ofrecen un mecanismo para la
identificación (genes de resistencia a
los antibióticos que actúan como
marcadores
seleccionables) y
la
recuperación
de
las
moléculas
recombinantes.
BanHi (39)
BAD promoter
EcoRV (4159)
His-tap
Ncol (1070)
Kpnl (1088)
AraC
GST
BamHI (1090)
EcoRI (1096)
Sect (106]
TEV-site
Sall (1109)
Ndel (3514)
4773 bp
Hind##1 (1315)
Bagi (122)
Nett (1122)
Khal (1130)
Ampicilin®
PUC origin
Pvul (078)
12
pBADM-30(+)BIOTENOLOGÍA

Tipos de Vectores de Clonación

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
VECTORES DE CLONACIÓN
Son moléculas que transportan y replican fragmentos de ADN que
llevan insertados.
Bacteriófagos: son virus
que sirven de portadores de
Material genético a bacterias.
Plásmidos
Furla de
cloracon
anpdira
Race-HI
Plásmidos son
moléculas de ADN
extra cromosómico
de forma circular en
bacterias.
TTAA
Gen
CITAA
0
0
TC
CITA4
GAATT
AATTC
Pláunido
Plaumido
mán ges
Cósmidos son
vectores sintéticos que
combinan
características del fago
lambda que posee
extremos cohesivos o
regiones cos.
Salcedo, 2014
13Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
BIOTENOLOGÍA

Clasificación de Vectores de Clonación

TIPOS DE VECTORES DE CLONACIÓN
Plasmidos bacterianos
Bacteriófagos o fagos 2
Cósmidos
Fásmidos (Fagémidos)
Combinación de un fago filamentosos (M13) y un plasmido
(pBR323)
Cromosomas artificiales
Se desarrollan para clonar grandes segmentos de
cromosomas eucariotas.
14BIOTENOLOGÍA

Ventajas de los Plásmidos como Vectores

Paula GARCÍA-GODOS ALCÁZAR
VENTAJAS DE LOS PLÁSMIDOS
VENTAJAS DE LOS PLÁSMIDOS
COMO VECTORES DE CLONACIÓN
Mayor estabilidad del ADN circular
durante su aislamiento químico.
Facilidad de aislamiento y manipulación
por su pequeño tamaño.
Presencia de un origen de replicación
independiente, fuera del control del
cromosoma.
La existencia en una célula de varias
copias haciendo posible la amplificación
del ADN.
Fácil detección y selección de clones por la
presencia de marcadores específicos
(genes de resistencia a antibióticos).
ESTRUCTURA DEL PLÁSMIDO pBR332
Resistencia a
la ampicilina
Cla I
EcoR I
Hind III
BamH I
Pts 1
Zonas de corte
para enzimas de
restricción
Sall
Origen de la
replicación de ADN
1
Resistencia a
la tetraciclina
https://slideplayer.es/slide/26238/
15