Auxiliar 3 Unidad 3: Métodos de modificación de genes por mutagénesis

Ingeniería Química, Biotecnología y Materiales

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS UNIVERSIDAD DE CHILE

O O AUXILIAR 3 Unidad 3

O O O BT4114 Biotecnología molecular 2025 SOFÍA MIHOVILOVIC Y FRANCISCO MOLINAO D

Unidad 3: Mutagénesis Racional y al Azar

MÉTODOS DE MODIFICACIÓN DE GENES: MUTAGENESIS RACIONAL Y AL AZAR.

C 0 O C C 0 0 C O O CUNIDAD 3:

1. Ingeniería de proteínas
2. Propiedades a mejorar
3. Estrategias de ingeniería de proteínas
4. Estrategia racional
5. Estrategia evolución dirigida
6. Etapas evolución dirigida
7. Generación y análisis de la librería
8. PCR propenso a errores
9. ¿ Cuántos clones se deben analizar?
10. Determinación de condiciones de mutagenesis de forma empírica
11. Mutagénesis por saturación de sitio
12. Métodos de mutagénesis al azar por recombinación
13. Identificación de variantes mejoradas

Ingeniería de Proteínas

Secuencia de la proteína otorgada por la información genética. SECUENCIA Se pueden generar variantes mutando regiones específicas del ADN para obtener nuevas versiones de proteínas. Gly - Leu Met Ser Ser ON Thr Val La estructura de la proteína viene dada por la secuencia de AA. ESTRUCTURA Al conocer la estructura, se pueden hacer mutaciones racionales para modificar funciones específicas. La función viene determinada por la estructura tridimensional. FUNCIÓN Podemos optimizar funciones deseadas mediante la selección o diseño de variantes más eficientes, estables, rápidas, etc.

Propiedades a Mejorar en Proteínas

Funciones Biológicas y Aplicaciones

FUNCIONES BIOLÓGICAS: -Catalizadores. -Mediadores de la respuesta inmune. -Unidades de control -Andamios estructurales.

Mejoras en Aplicaciones

MEJORAS EN APLICACIONES: Síntesis química Biorremediación . Sensores químicos Fármacos . Control metabólico

Malas Propiedades de Proteínas

MALAS PROPIEDADES -Baja actividad en reacciones no naturales. -Estabilidad marginal. -Sensibilidad a condiciones industriales. -Expresión baja en sistemas heterólogos.

Buenas Propiedades de Proteínas

BUENAS PROPIEDADES -Catalizan muchas reacciones químicas. -Alta especificidad: reconocen muy bien su substrato. -Requieren poca energía para funcionar.

Estrategias para Ingeniería de Proteínas

DIRECTED EVOLUTION SEMI-RATIONAL DESIGN RATIONAL DESIGN Mutagenesis Computer-aided design Random Recombination techniques Controlled randomization - Selection or screening Mutagenesis Site-directed Characterization Characterization

Estrategia Racional en Ingeniería de Proteínas

Modificación Planificada y Específica

Estrategia racional: · Modificar proteínas de forma planificada y específica · Se basa en conocimiento de información estructural y relación estructura- función de la proteína a mutar

Ventajas de la Estrategia Racional

VENTAJAS: Pocos mutantes para analizar, mas fácil probar las propiedades mejoradas

Desventajas de la Estrategia Racional

DESVENTAJAS: En general alcance es limitado · Se requiere disponer de mucha información · Algunas mejoras requieren múltiples cambios de secuencia · Cambios pueden afectar otras funciones

Mutagénesis Puntual por PCR

Método General

Estrategia racional: · Mutagenesis puntual por PCR Restriction site A Restriction site B Target DNA Synthesis of left fragment Synthesis of right fragment Purify, denature, renature DNA polymerase PCR with outer primers I Digest with restriction enzymes A and B Wild type CAG GTC (5) translation Val Wild type protein Mutant CGG GCC (6) translation Thr Mutant protein

Método del Plasmidio Completo

Estrategia racional: · Mutagenesis puntual por PCR: método del plasmidio completo. TAC ATG. ATG .TAC (a) Denature A G + CH CH3 CH3 (CH3 CH3 (CH3 CH CH3 CH3 CH3 ICH3 (c) PCR (few rounds with Pfu polymerase) TTC AAG n TTC -AAG TAC ATG n + n + CH CH CH3 CH3 n CH3 (CH3 CH2 CH3 Transforms Does not transform (b) Anneal mutagenic primers T' A G T C CH3 (d) Dpn TAC ATG

Mutagénesis Sitio Dirigido

Inserción de Secuencias Largas

Estrategia racional: · Mutagenesis sitio dirigido: inserción o deleción de secuencias más largas Inserción: A Step 1: Primary PCR e a a 444444 b d a AB TILIDADE CD Step 2: Ligation PCR d f

Deleción de Secuencias Largas

Deleción: B Step 1: Primary PCR c b 1 C 0008-08+ ..... a AB d CD ...... EF Step 2: Ligation PCR 1

Estrategia: Evolución Dirigida

Mutagénesis Aleatoria Puntual

Evolución dirigida: · Random mutagénesis: 1. Mutagénesis aleatoria puntual: Se introducen mutaciones aleatorias en puntos específicos del gen por errores inducidos durante la replicación · Error-prone PCR · Mutator strains · RID (Random Insertion and Deletion): · Saturation mutagenesis

Recombinación en Evolución Dirigida

2. Recombinación: -Se genera diversidad recombinando regiones de genes diferentes -Puede ocurrir entre genes similares o combinando segmentos incompatibles Homóloga: · DNA shuffling · Family shuffling · StEP No Homóloga: Exon shuffling, DHR, ITCHY, THIO-ITCHY, RM-PCR, SCRATCHY, SHIPREC, SISDC, YLBS

Mutagénesis Aleatoria con E. coli XL-red

Evolución dirigida: . Random mutagenesis: E. coli XL-red cells Es una cepa hipermutadora porque tiene mutaciones en tres genes de reparación de ADN: · mutS: reparación de errores de apareamiento · mutD: exonucleasa 3'->5' · mutT: eliminación de nucleótidos oxidados Frecuencia de mutación es ~5000 veces mayor que una cepa normal PFE-WT Plasmid bearing PFE wild type (WT) gene PFE-Mut XL1-Red Transform wild type into Epicurian Coli XL1-Red competent cell: incubate overnight Diluted aliquot for next mutation cycle PFE-Mut Plasmid bearing PFE-mutant gene PFE-Mut Transform mutant into non-mutator E. coli host; prepare master plates E. coli Replica plate onto minimal media containing rhamnose, substrate 1 or 2, and indicators Select and cultivate positive clones, isolate esterase variants to prepare biotransformation, and determine number and position(s) of mutation(s) Mutants improved further in subsequent cycles

Etapas de la Evolución Dirigida

1 .- IDENTIFICACIÓN DEL GEN Gen de proteína de interés 2 .- GENERACIÓN DE DIVERSIDAD GENÉTICA Generar librería de variables genéticas ¿QUÉ ES? Una versión de la selección natural pero en laboratorio 3 .- CLONACIÓN Y EXPRESIÓN Se transfieren a un sistema para ver sus efectos 4 .- SCREENING O SELECCION 5 .- RECUPERACIÓN Y VALIDACIÓN - Selección de variantes funcionales y luego las mejores Se utilizan los mejores clones y se repiten los pasos para pulir la proteína mutada

Generación y Análisis de la Librería

Colección de genes mutados Introducción de genes mutados en un sistema huésped Inducción expresión de las proteínas mutantes. Cada clon produce una versión distinta de la enzima (1) Generation of mutant library via ep-PCR (2) Transformation (3) Expression 1 4-hittaft mslinh pET24=(+)- ep-SSDHAD 6964 bp performance Evaluación de actividad de cada variante (6) Assay (5) Pretreatment & dehydratase reaction (4) Cell disruption Liberación de proteínas desde la célula Se inicia la reacción enzimática

PCR Propenso a Errores

GEN DE INTERÉS [MGCI2] ALTO Estabiliza pares no complementarios DESBALANCE DE DNTP Aumenta la probabilidad de inserción incorrecta Nº DE CICLOS DEL PCR Propagación de errores PCR USO DE TAQ POLIMERASA No tiene actividad exonucleasa 3'->5' [MNCL2] Disminuye la especificidad de la polimerasa (compite) ANÁLOGOS DE DNTP Ej: 2-amino purina, 5-bromo uridina. Afectan el emparejamiento de bases

Análisis de Clones

NÚMERO DE POSIBLES VARIANTES DE UNA PROTEÍNA 19M [N!/(N-M)! M!] M: Cambios simultáneos en una secuencia N: Largo de la secuencia (aminoácidos) PARA UNA MÁXIMA REPRESENTATIVIDAD DE TODAS LAS VARIANTES SE ESTIMA X 10 EL TAMAÑO DE LA LIBRERÍA

Determinación Empírica de Condiciones de Mutagénesis

Librerías de mutantes preparadas bajo 3 concentraciones distintas de DNA &.v 1.5- Normalized Activity 3 [DNA ] 1.0 - 0.5 50 ng 0.5 ng 5 ng 0.0- 0 50 100 150 200 Mutant · Permite conocer condiciones de la mutagenesis deseadas . Trade-off entre actividad enzimática y diversidad

Mutagénesis por Saturación de Sitio

PRIMERS PARA PCR: XXX NNN XXX · Suficiente información estructural y funcional · Se exploran otros aminoácidos para una determinada posición · Ventaja: Se puede sustituir un aminoácido en específico por los otros 19 · Reducción del screening Wild type 15A - E 15C E D ISD 15E E E 15F 150 ISH 1 H 15K 15L M 15M 15N 15P 150 15R 155 - E IST ISV = 15W F - 15Y M P E . F E

Métodos de Mutagénesis al Azar por Recombinación

DNA Shuffling: Fragmentación de Secuencias Homólogas

O DNA SHUFFLING ETAPA 1: FRAGMENTACIÓN DE SECUENCIAS HOMÓLOGAS DNAsas - RILO

DNA Shuffling: Hibridación de Fragmentos

12 MÉTODOS DE MUTAGENESIS AL AZAR POR RECOMBINACIÓN DNA SHUFFLING ETAPA 2: HIBRIDACIÓN DE FRAGMENTOS POR SECUENCIAS HOMÓLOGAS / PCR SIN PRIMERS Unión entre fragmentos de secuencias originales - 25 30 35 40 45 cyclesO

DNA Shuffling: Amplificación con Primers

12 MÉTODOS DE MUTAGENESIS AL AZAR POR RECOMBINACIÓN DNA SHUFFLING ETAPA 3: AMPLIFICACIÓN CON PRIMERS Gen con largo original CHIPS! b 25 30 35 40 45 cycles

Identificación de Variantes Mejoradas

Screening en Formato Líquido

SCREENING FORMATO LÍQUIDO · (3) Cada pocillo recibe una sola colonia clonada. Se crece la biomasa y se puede almacenar a -80℃. · (4) Se hace un "replicado" de la master plate. Se cultiva en un medio que induce la expresión del gen. · (5) Se rompen las células para liberar enzimas mutantes. Se transfiere el extracto crudo a una placa de ensayo funcional. Ensayo enzimático. (1) (2) epPCR Transformation into E.coli BL21 SeSaM Mutants (Colony) (106-107) Gene library (107-103) (6) Identify and characterization of improved variants (compare to parent) Transfor into MTP Cultivation overnight Addition of glycerol (3) Cell harvesting Cell lysis Transfer to assay plate Replica plating; 16 h cultivation in auto-induction media 00 Expression Plate Master Plate Assay plate for screening and rescreening (5) (4)

Screening en Medio de Cultivo

13 IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES MEJORADAS SCREENING MEDIO DE CULTIVO · (3) Se transfieren las colonias a una membrana de nitrocelulosa. · (4) Se induce la expresión de la proteína objetivo en una placa de inducción. · (5) Se permeabilizan las células usando vapor de cloroformo (liberación de enzimas). · (6) Se eliminan las impurezas con una placa de diálisis. · (7) En una placa de ensayo se verifican las colonias correctas. B TA 1. Plasmid Transformation into E. coli (GO) 1 7. Screening for Active Variants on Assay Plate 1 2. Colony Growth on LB Agar Plate (Antibiotics) 6. Removal of Background Noise on Dialysis Plate 1 3. Colony Transfer on Nitrocellulose Membrane 4. Protein Expression on Induction Plate (IPTG. Antibiotics) 5. Cell Permeabilization in Chloroform Vapor (Desiccator)