Purificación de ácidos nucleicos: cromatografía y esferas magnéticas

Índice

3.1 Introducción 3.3 Extracción 3.5 Automatización del proceso 3.7 Almacenamiento de los AN purificados

• Pretratamiento 3.2 Purificación 3.4 Calidad de los AN purificados 3.63.4. Purificación de los ácidos nucleicos

Purificación de ácidos nucleicos

Eliminación de restos celulares

Tras la lisis celular, los ácidos nucleicos se encuentran inmersos en un extracto celular complejo mezclados con restos de orgánulos celulares, proteínas, sales minerales ... y los propios reactivos empleados en la extracción del lisado. Es necesario separar los ácidos nucleicos de los demás componentes

Lisis celular

Muestra de diferentes origenes Mecánica Química Enzimática Ácidos nucleicos + proteínas (disolución) Rotura membranas Precipitación macromoléculas Lisis Eliminación restos Restos celulares (pellet/precipitado) Fuente: Cabrero, 2021.

Técnicas de purificación

Purificación con solventes orgánicos

Fenol- Cloroformo- Isoamílico Lisado Vórtex Fase acuosa Acetato sódico Fase orgánica Tampón TE Etanol 70-95% ADN Etanol 100% ADN genómico [ https://www.youtube.co m/watch?v=a8d8ZNSX88 0&ab channel=akademei aUFM (minuto 4:11)

Técnicas de purificación: Purificación con solventes orgánicos

BASE: se basa en la diferencia de solubilidad de los compuestos integrantes del lisado celular en solventes orgánicos PROCEDIMIENTO:

1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos
2. Precipitación del ADN
3. Lavado del ADN
4. Resuspensión del ADN

Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos

Solventes orgánicos más habituales: Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1. PASOS: Mezcla: Lisado + reactivo (inmiscibles en agua). Agitación con vórtex. Lisado: fase acuosa. Cloroformo: disuelve lípidos y proporciona fase orgánica a la mezcla. Fenol: desnaturaliza y disuelve proteínas del lisado, se integra a fase orgánica. Centrifugación: Separación en: Fase acuosa (parte superior del tubo): ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles. Fase orgánica (parte inferior del tubo): proteínas y lípidos.

Fenol- Cloroformo- Isoamílico Lisado Vórtex Fase acuosa Fase orgánica

Precipitación del ADN

PASOS: 1. Fase acuosa a tubo limpio. 2. Adición de acetato sódico e isopropanol/etanol 100% frío -> Precipitación ADN 3. Centrifugación: · Sobrenadante: Componentes contaminantes hidrosolubles · ADN precipita en el fondo del tubo.

Fase acuosa Acetato sódico Ise ánica ADN Etanol 100% CS Escanea do cor CamScanner

Precipitación del ADN con etanol y acetato sódico

? ¿Por qué el ADN precipita con el etanol y el acetato sódico? ADN -> Molécula polianiónica (carga negativa)-> En medio acuoso-> cargas negativas hacen que moléculas de ADN se repelan. Reaccionan con el agua y se rodean de esta-> ADN es soluble en agua

Etanol: Capta moléculas de agua (no se unen a ADN) e - Sodio: Neutraliza cargas negativas - Se forma red / maraña entre moléculas de ADN (se hace visible)

Lavado del ADN

Tras eliminar el sobrenadante, el pellet de ADN se lava con etanol

Etanol 70-95% ADN Centrifugación: Parte insoluble (pellet): ADN es insoluble en etanol Parte soluble (sobrenadante): Restos de sales y posibles contaminantes.

Resuspensión del ADN

Hay que eliminar el etanol (interfiere en otras técnicas) >Pellet de ADN se deja secar con el tubo abierto a temperatura ambiente. Resuspensión con agua destilada o tampón de baja fuerza iónica a PH neutro o poco alcalino (Tris- EDTA).

Tampón TE Etanol 70-95% A ADN genómico Rehidratación del ADN-> proceso lento: Incubación inicial a 55-65°C. Segunda incubación (Temperatura suave) con agitación o incubación en nevera durante un día a 4℃. video

Técnicas de purificación

Precipitación con sales (o salting out)

BASE: Precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. Las concentraciones salinas producen elevada fuerza iónica > Dificultan solubilidad > Precipitación de proteínas. PROCEDIMIENTO:

1. Precipitación de proteínas
2. Precipitación del ADN
3. Lavado del ADN
4. Resuspensión del ADN

Técnicas de purificación: Precipitación con sales (o salting out)

BASE: Precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. Las concentraciones salinas producen elevada fuerza iónica > Dificultan solubilidad > Precipitación de proteínas. PROCEDIMIENTO:

Solución de lisis de eritrocitos Solución de lisis Solución precipitante celular de proteínas Sobrenadante Isopropanol Etanol 70% ADN Pretratamiento y lisis celular Sobrenadante Sangre anticoagulada Leucocitos Lisado Proteínas Tubo limpio ADN Sobrenadante Tampón TE ADN Secar ADN purificado en solución Sobrenadante

Precipitación de proteínas

Se añade al lisado un volumen igual de solución salina concentrada Agitación (vórtex): 20-30 segundos. IKA" VORTEX 2 Centrifugación: Proteínas en el fondo del tubo (pellet proteico). Sobrenadante: ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles.

Solución de lisis celular Solución precipitante de proteínas Pobrenad Sobrenadante cocitos Lisado Proteínas

Precipitación del ADN con isopropanol

Transferencia del sobrenadante a un tubo limpio. Adición de isopropanol (mismo volumen) y mezclar (inversión tubo varias veces). Precipitación de ADN (hebras blanquecinas) Centrifugación > Sedimentación de ADN.

Sobrenadante Isopropanol ADN einas Tubo limpio ADN

Lavado y resuspensión del ADN

Eliminación del sobrenadante Lavado del ADN con etanol (70-95%) -dejar evaporar etanol- Resuspensión en agua destilada o tampón tris-EDTA (TE).

ropanol Etanol 70 % Sobrenadante ADN Tampón TE ADN Secar ADN purificado en solución Sobrenadante

Técnicas de purificación

Cromatografía de intercambio iónico

BASE: Unión electroestática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria/sólida.

Proteína 1 2 3 4 5 6 K + + Matriz + Soluto

Intercambiadores aniónicos y catiónicos

INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS: Grupos de la fase estacionaria con carga neta positiva. INTERCAMBIADORES CATIÓNICOS: Grupos de la fase estacionaria con carga neta negativa.

Fase estacionaria + - + 1 1 Faso sólida Fase sólida ++ ++ 1 Anion con fuerte carga negativa Anion con débil carga negativa

Funcionamiento de la cromatografía de intercambio iónico

¿ Cómo funciona? Fase estacionaria: matrices de sílice o celulosa empaquetadas en columnas de polipropileno.

1 2 3 4 5 6 444

Unión de ácidos nucleicos a la matriz

¿Cómo funciona? 1). Se carga la columna con el lisado> A la matriz se une covalentemente un intercambiador aniónico (positivo)> porque así podemos unir los ácidos nucleicos (carga negativa). Unión de ácidos nucleicos (carga negativa). a la matriz sólida cargada positivamente de la columna 2). Otras moléculas (proteínas, polisacáridos, contaminantes) poseen carga positiva y no se unen a la matriz positiva (se eluyen)

® + + C O . + + + + ¢ + 0 + + ¢ + 0 ¢ 0 ¢ + + + ¢ + 2 3 4 5 6 - flujo de solvente

Intercambiadores aniónicos más usados

Los intercambiadores aniónicos más usados-> metilaminoetanol (MAE) y dietilaminoetil (DEAE). MAE: metilaminoetanol CH, CH2-CH2-OH Sitio de unión Matriz DEAE: dietilaminoetil CH2- CH3 -CH2-CHÍNH CH2-CH3 Sitio de unión Matriz No examen

Separación de ácidos nucleicos de la columna

¿Qué pasa con los contaminantes que tengan carga negativa como los ácidos nucleicos? 3 y 4). Lavado de la columna con tampones de concentración salina creciente, eliminando contaminantes con carga negativa débil. * ¿ Cómo se separan los ácidos nucleicos de la columna al final del procedimiento? 5 y 6). Separación de ADN de la columna con > Tampón de máxima salinidad y alto pH.

1 2 3 4 5 6 Lavado de columna con tampón de máxima salinidad-> separación del ADN

Final del procedimiento de cromatografía

Una vez obtenido el ADN de la columna-> 7). Precipitación de ADN con isopropanol o etanol (eliminar sales). 8). Lavado con etanol (eliminar restos de etanol) 9). Resuspensión en agua destilada o tampón.