Introducción a la biología celular: conceptos básicos y organización

CONCEPTOS BÁSICOS

CÉLULA

Es la mínima unidad morfofuncional dotada de vida independiente. La Citología clásica estudia la estructura celular utilizando principalmente técnicas de microscopia. La teoría celular nace en el S. XIX con las mejoras del microscopio optico y se desarrolla durante el S. XX con el microscopio electrónico. Integrando conocimientos de otras disciplinas (bioquímica, genetica), la Citología clásica se ha transformado en la actual Biología Celular, que trata el estudio integral de la célula: estructura, función, ciclo vital, interacción entre ellas y con el medio que les rodea.

TEJIDO

Es un conjunto organizado de células (y matriz extracelular) de origen embriológico común y función especializada. Entre los tipos básicos, encontramos los siguientes: epitelial, conectivo, muscular y nervioso. La Histología estudia los tejidos e integra conocimientos de diversas disciplinas (bioquímica, fisiología, inmunología, patología).

ÓRGANO

Es un conjunto de diferentes tejidos que forman una estructura anatómica visible con funciones concretas (cerebro, hígado, corazón, riñón). En su estructura, podemos distinguir:

• Parénquima o tejido parenquimatoso. Tejido especializado que realiza la función del órgano, como los hematocitos del hígado.
• Estroma. Tejido que aporta vasos sanguíneos, sosten mecánico y nutricional al parenquima. Normalmente pertenece al tejido conectivo.

APARATOS Y/O SISTEMAS DE ÓRGANOS

Ambos términos designan un conjunto de órganos que contribuye a realizar una función general común. Un sistema está formado por órganos semejantes en estructura y origen, ya que predomina un mismo tipo de tejido de origen embriológico común (sistemas óseo, muscular, endocrino, nervioso, inmune-linfoide). Un aparato, en cambio, está constituido por órganos diferentes en estructura y origen (aparatos locomotor, digestivo, respiratorio, urinario, genital, circulatorio). El aparato locomotor, por ejemplo, está formado tanto por músculos como por huesos. La Organografía/Histología de Sistemas estudia la estructuración del organismo humano en órganos integrados en aparatos y/o sistemas con funciones específicas.

SISTEMA DE MEDIDAS Y LÍMITE DE RESOLUCIÓN

LR del ojo humano = 0.2 mm = 200 µ m LR del M.O: 0.2 um LR del M.E.T .: 0.1- 0.2 nm = 0.0001 µ m LR del M.E.B .: 10-20 nm = 0.01 µ m 1 mm = 1000 um (micras) 1 um = 1000 nm (nanómetros) 10 nm = 10 Å (Ångströms) Límite de resolución (LR): distancia mínima entre dos puntos para que sean distinguibles, y equivale a la longitud de onda (2) partido de la apertura numérica (AN). El LR será más pequeño y discriminativo cuanto menor sea la 2 de la fuente de luz, mayor sea la AN del lente objetivo del M.O., mayor aumento haya de los lentes (ocular y objetivo), menor grosor tenga la sección de tejido, y más adecuada sea la fijación y la tinción. Cuanto menor es el LR, mayor es el poder resolutivo (capacidad de un microscopio de percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos).Determinación de la apertura numérica Objetivo del microscopio AN = n × sen e 8 = 58 8 = 40° Ejemplos: Objetivo seco: AN = 1.00 x sen 40° AN = 0.64 (<1) Lente n = 1.52: Objetivo de inmersión: AN = 1.52 x sen 58° AN = 1.29 (>1) La AN mide la capacidad de recoger luz del lente objetivo. Por tanto, es un parámetro de M.O. y propio de cada objetivo. Normalmente la ) es fija en los M.O., así que la resolución depende de la AN del objetivo. Tipos de microscopios Óptico: técnica empleada para ver de cerca una muestra con el aumento de una lente con la luz visible. Electrónico de transmisión: técnica usada para observar las características de especímenes muy pequeños. Electrónico de barrido: técnica que utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. AN = n . sin 0, donde n es el índice de refracción de la luz en el medio y 0 el ángulo de apertura del cono de luz formado entre el eje óptico del objetivo y el rayo de luz más externo captado por el mismo. En el microscopio electrónico de transmisión (M.E.T.) la resolución depende de la À del haz de electrones (pues carece de objetivo), que varía según su aceleración (a mayor aceleración, menor ), por lo que aumenta la magnificación de la imagen). El M.E.T. tiene mayor poder resolutivo que el microscopio óptico (M.O.) por la menor À del haz de electrones. El LR del M.O. depende de la AN del objetivo. NIVELES DE ORGANIZACIÓN CELULAR EUCARIOTA PROCARIOTA Diámetro medio 10-50 micras 0'1-1 micra Ribosomas 80s (60s + 40s) 70s (50s + 30s) Diana del 40% de los antibióticos Núcleo Membrana doble (envuelta) Ausente (nucleoide) ADN doble lineal con histonas ADN doble circular sin histonas División Mitosis/meiosis Bipartición Membrana celular Simple Simple o doble (en gramnegativas) Orgánulos membranosos Retículo endoplasmático, Golgi Ausentes Citoesqueleto Presente Ausente Enzimas respiratorias En las mitocondrias En el citosol Tipos Animales Bacterias (pared celular: peptidoglicano- mureina) Vegetales (pared celular: celulosa) Hongos (pared celular: quitina) Protoctistas (algas, protrozoos, etc.) Membrana celular flagelos 2 pil Cápsula pared celular (diana de la penicilina) Nucléolo " 10 Núcleo ribosomas 7 ADN 6 5 Membrana celular Ribosomas RER Micoplasmas (sin pared celular) Aire, n = 1 Aceite, n = 1.52 La AN es una expresión matemática Porta de vidrio n = 1.52 que indica la forma en que la luz es concentrada por el condensador y Aire, n = 1 Aire, n = 1 Fuente de luz captada por el objetivo. Aumenta en los objetivos de inmersión (se observa la muestra a través de una capa de medio de inmersión, normalmente aceite), siendo más resolutivos que los objetivos secos (no hay ningún medio entre la muestra y el objetivo).Coeficiente de sedimentación (s) de una partícula (en este caso, los ribosomas) se utiliza para caracterizar su comportamiento en los procesos de sedimentación.

PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO

La utilidad del procesamiento histológico consiste en:

1. Poder realizar un diagnóstico a partir de biopsias, necropsias, frotis, etc.
2. Poder generar nuevos tratamientos (innovación biomédica). I. Fase preclínica de la investigación biomédica. Antes de estudiar en humanos, hay que tomar la muestra en cuestión y cultivarla. Después de esto, se experimenta en animales vivos, para ver cómo se comporta el medicamento en un sistema vivo. Una vez superada esta fase, se pasa a la experimentación en humanos, constituyendo la fase clínica. En esta fase preclínica es donde se aplica el procesamiento histológico. Las fases de la investigación biomédica son el procedimiento común para medicamentos y todo tipo de dispositivos de uso sanitario. Conceptos importantes Biopsia: extracción o extirpación de una pequeña porción de tejido para examinarla en el laboratorio. Necropsia: estudio realizado a un cadáver para investigar y determinar las causas de su muerte. Frotis: método que consiste en realizar una extensión de un tejido o secreción sobre un portaobjetos y examinarla con el microscopio. Preclínico Fase 1 Fase 2 Fase 3 Revisión de la FDA Fase 4 1 .- Cultivos celulares 2 .- Experimentación animal aplicando las 3 R (reducir, reciclar y refinar) Para confirmar la inocuidad y eficacia 20-80 100-300 1,000-3,000 1,000+ Participantes Participantes Participantes Participantes sanos Medicamento aprobado para pruebas en seres humanos Medicamento presentado para aprobación por parte de la FDA Medicamento aprobado Regla de las 3R: reciclar (emplear el mismo animal varias veces para evitar involucrar a más), refinar (verificar que un tratamiento es efectivo en un cultivo de bacterias, en el caso de que sea posible, y así evitar el uso de animales) y reducir (utilizar la menor cantidad posible de animales en la experimentación).
3. Ingeniería tisular. Consiste en una disciplina científica que busca la regeneración de tejidos y órganos a partir de biomateriales que simulan o sustituyen a los naturales. Por ejemplo, la piel artificial.

PROCESAMIENTO PARA M.O. Y M.E.T.

Normalmente, la técnica histológica pretende obtener secciones de órganos fijados y teñidos para el estudio de su estructura (secciones que dejen pasar la luz, 3-10 um grosor) y ultraestructura microscópica (secciones que dejan pasar el haz de electrones, 80 nm grosor). Las bacterias (procariotas) y mitocondrias (de eucariotas), con 0.5 um de diámetro, son las estructuras más pequeñas observables en el M.O. básico (LR = 0.2 um). Con el microscopio confocal, obtenemos secciones ópticas dentro de cada sección histológica marcada con fluorescencia. Las técnicas de inmunofluorescencia permiten identificar biomoléculas y estructuras subcelulares. No trabajamos con secciones de órganos/tejidos cuando usamos frotis celulares, M.E.B o cultivo de tejidos/células vivas. Podemos procesar cultivos de tejidos/células para obtener secciones (normalmente para MET). La combinación de tinciones y otras técnicas nos permite obtener varios enfoques de un mismo tema. Una misma célula, por ejemplo, es visible en varias secciones histológicas consecutivas (se puede obtener la misma célula en distintos cortes), lo cual sirve para ver la misma célula con coloraciones diferentes, y así contrastar información.

TÉCNICAS EMPLEADAS EN EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO

Microscopia de contraste de fases: permite observar células sin colorear y es especialmente útil para células vivas. Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. Por ejemplo, la luz no se comporta igual en el núcleo (más denso) que en el citosol (más líquido).Frotis: método de exploración microscópica de un fragmento de tejido o secreción que consiste en realizar una extensión sobre un portaobjetos y examinarla con el microscopio. Algunos de los tintes más empleados en determinadas técnicas son: la hematoxilina (color verdoso), la eosina (color rosado), el azul metileno y el naranja G. El nombre de un granulo viene dado por el colorante que resulta efectivo. Algunos ejemplos son los eosinófilos (eosina) y los granulocitos basófilos (colores básicos, como la hematoxilina y el azul metileno). Cultivo celular. Microscopia de contraste de fases + fluorescencia. Tinción nuclear con marcador fluorescente azul (Hoescht) Frotis sanguíneo. Tinción de Wright Frotis vaginal. Tinción de Papanicolau (Azul metileno + Eosina) (Hematoxilina + Naranja G + Eosina)

PASOS DEL PROCESAMIENTO DE CÉLULAS/TEJIDOS PARA M.O. Y M.E.T.

1. Obtención de la muestra celular/tisular:

• Tipo de muestra. Puede ser una muestra líquida (como la sangre, para realizar una extension. En este tipo de preparaciones se puede pasar directamente al paso 5), o un tejido (procedente de una biopsia, de una resección quirúrgica o una necropsia).
• Tamaño óptimo de la pieza: 5-10 mm3 para M.O. y 1 mm3 para M.E.T.

2. Fijación.

Facilita la coloración. Consiste en exponer la preparación a una serie de líquidos fijadores para evitar su degradación (autolisis), y conservar así la estructura.

3. Inclusión para obtener un bloque.

Los bloques permiten obtener secciones delgadas de espesor y superficie homogéneas, para que la luz puede atravesarlas.

• Congelación (M.O.). Ya se endurece lo suficiente como para poder cortarla. Es el procedimiento más rápido. A la vez que se congela, se produce también la fijación.
• Inclusión en parafina (M.O.). Es mucho más frecuente. La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de hidrocarburos saturados.
• Inclusión en resina epoxi (M.E.T.). Consiste en incluir el tejido en un material de alta dureza como son las resinas de tipo epoxi, que se infiltran en el tejido en forma líquida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular.

4. Obtención de secciones (grosor 3-10 um para M.O. y 80 nm para M.E.T.).

• Si es un bloque congelado, se emplea un criostato (aparato que sirve para mantener temperaturas muy bajas).
• Si es un bloque de parafina, se emplea un microtomo de parafina (máquina que combina tejidos y cera para realizar cortes).
• Si es un bloque de resina plástica, se emplea un ultramicrotomo (aparato que permite la obtención de secciones ultrafinas).

5. Tinción.

Proceso por el que las moléculas de un colorante se absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar así la observación en microscopio.

• En M.O. se utilizan colorantes de rutina, técnicas histoquímicas (técnicas que permiten detectar determinadas biomoléculas) o inmunohistoquímicas (técnicas que, mediante el uso de anticuerpos, permiten detectar biomoléculas completas, las que interesa investigar).