Replicación del DNA: polimerasas y mecanismos de reparación en biología

REPLICACIÓN DEL DNA

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN

El metabolismo del DNA comprende el proceso mediante el cual se hacen copias 'fieles' de las moléculas de DNA (REPLICACIÓN), junto a los procesos que afectan a la estructura inherentes a la información (reparación y recombinación) Cada una de las cadenas es complementaria de la otra. Cada cadena molde parental genera una cadena 'hija' cuya secuencia es predecible y complementaria

Replication avoc DNA Transcription RNA Translation Protein

Necesidad de alto grado de precisión (los errores cometidos pueden tener funestas consecuencias: el cambio es hereditario) y velocidad (moléculas de millones de bases) Desafío: Separación de hebras en lugar determinado y soportar la tensión (superenrollamiento que provoca) Determinados procesos requieren 'intercambio de material entre moléculas parentales': recombinación: generación de diversidad en secuencias de anticuerpos, integración de genoma viríco en DNA hospedador, ...

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN

1. .- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff.
2. .- Carácter semiconservativo.
3. .- Síntesis de replicación 5'->3'.
4. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
5. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
6. .- Origen fijo de replicación: replicones.
7. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
8. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

TIPOS HIPOTÉTICOS DE REPLICACIÓN

I CONSERVATIVA SEMICONSERVATIVA DISPERSIVA

EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL: REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA

DNA extracted and centrifuged to equilibrium in CsCI density gradient Cultivo celular en medio pesado (15N) (a) Heavy DNA (15N) - Original parent molecule Transfieren las células a medio ligero (14N) (b) Hybrid DNA (15N-14N)- First-generation daughter molecules (c Light DNA (14N) - Hybrid DNA Second-generation daughter molecules

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (II)

1. .- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff.
2. .- Carácter semiconservativo.
3. .- Síntesis de replicación 5'->3'.
4. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
5. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
6. .- Origen fijo de replicación: replicones.
7. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
8. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Sentido de Síntesis (Replicación): 5-3'

Cebador(primer) 5' -PIT 73'-OH 3'-OHLI 5'-P DNA molde Sentido de Lectura del molde: 3'+5' - Sentido de la síntesis 5'->3' El DNA es sintetizado por Enzimas DNA polimerasas Precursores 5'-trifosfato de nucleótido y sólo pueden unirse al 3'-OH de la desoxiribosa Phosphate Purine or pyrimidine base O 5 -O-P-+O-CH2 O ₿ Ö H H Pentose H H 3' 2'1 OH H - Necesidad de Cebadores o Primers (la DNApol los necesita para empezar a copiar) Sintetizados por Enzimas primasas: son AN (RNA) de 7-10 nucleótidos (complementarios del extr. 3' cadena DNA molde), comienzo de síntesis para DNApol 4'

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (III)

1. & om plementariedad entre bases del DNA (DNA molde): nicrada la replicacion desde er Chargafeplican siempre en un orden determinado (uno tras otro), BroSintesisdde replicación géogidos que son añadidos antes que Ja DNApol se disocie
2. .- Carácter semiconservatiyazar
3. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
4. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
5. .- Origen fijo de replicación: replicones.
6. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
7. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (IV)

1. .- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff.
2. .- Carácter semiconservativo.
3. .- Síntesis de replicación 5'->3'.
4. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
5. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
6. .- Origen fijo de replicación: replicones. L l a z o o e s p l i c a s c i ó n p s e i d c o n p s e o g e n s d e k a z o a i c u a : a e n p u o denominado origen Trozo DNA que se replica con un único origen de replicación : replicón d e c n s
7. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
8. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Sitios específicos de origen de la replicación (E. coli)

En eucariotas varios orígenes fijos de replicación En E. coli uno único para todo el genoma: oriC (un solo replicón) 9-mer Binding sites for dnaA protein Tandem array of 13-mer sequences (AT rich) 1 1 -> V 1 13-mer Secuencia de 13 p.b. 5'- GATCTNTTNTTTT-3' 3'- C TAGANAANAAAA-5' Consensus sequence oriC: 245 pb, con 3 secuencias casi idénticas en tandem (13-mer) y cuatro lugares de unión (9-mer) para la dnaA (proteína de iniciación cuya unión inicia secuencia sucesos)

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (V)

1. .- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff.
2. .- Carácter semiconservativo.
3. .- Síntesis de replicación 5'->3'.
4. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
5. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
6. .- Origen fijo de replicación: replicones.
7. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
8. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Replicación bidireccional: horquillas replicativas

El DNA bicatenario : las 2 hebras debe desenrollarse y separarse antes de ser replicado: requiere la intervención de enzimas Helicasas y Topoisomerasas Replicación evoluciona a ambos lados originando las burbujas u horquillas de replicación Los dos extremos tienen replicación activa: bidireccional 8 Bidirectional Replication forks Origin Un lirectional Origin Replicación de un cromosoma circular: exp de timidina marcada con tritio (3H) E.coli

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN (VI)

1. .- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff.
2. .- Carácter semiconservativo.
3. .- Síntesis de replicación 5'->3'.
4. .- Necesidad de Cebador o Primer: primasas.
5. .- Carácter secuencial de la replicación a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa.
6. .- Origen fijo de replicación: replicones.
7. .- Replicación bidireccional: horquillas replicativas.
8. .- Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Replicación semidiscontinua: fragmentos de Okazaki

Las 2 cadenas DNA son antiparalelas y Las 2 son sintetizadas en la dirección 5'->3' i¿cómo simultáneamente ?! 3' 5' Hebra Conductora o líder Dirección del movimiento de la orquilla de replicación 3' 5' 3' 5' Okazaki fragments 5'3' 3' 5' Hebra rezagada Okazaki (1968) (experimentos de Pulso y Caza) Cadena continua o conductora (leading strand) síntesis transcurre en la misma dirección que el movimiento de la horquilla (y continua). La otra cadena se sintetiza en fragmentos cortos 'de Okazaki' (cadena discontinua o rezagada "lagging strand") Fragmentos de Okazaki: -En E.coli de 1000 a 2000 nucleótidos -En eucariotas de 150-200 nucleótidos Necesidad de Ligasas y Primasas

DNA-POLIMERASAS

La DNA polimerasa es una enzima que cataliza la síntesis de DNA a partir de desoxirribonucleicos y de una molécula de DNA molde Kornberg (1958): primera actividad DNApol de E.coli: DNApol I Existen más enzimas DNA pol # en E. coli DNApol II, DNApol III, ... (al menos 5 DNApol) Reacción fundamental: (dNMP)n + dNTP -> (dNMP)n+1 + PPi 5' Fingers Thumb Fingers in 11 5' Thumb Growing strand Pol Palm 5' Palm 5' 3' 3 Template strand Exo Exo Requiere un "molde" y un "cebador" 5ºº P 3' 5' P P 3' 5" P P P 3' dATP PP; G G C 1 C C 1 G C A C G A C G A 3" P P 5' 3' Lololol P .5' 3' P P A T lolo 1 C 5' T Lololo P U G C A 1 dGTP PP; V 1 G 1 Pol

DNA polimerasa: requerimientos

-Molécula de DNA molde (según reglas de apareamiento) -Cebador: segmento de cadena (RNA complementario del molde) con extremo 3'-OH libre: extremo cebador o "Primer terminus" Cebador 5'-PIT 3'-OH 3'-OH Los 4 dNTPs como sustrato 5'-P DNA molde Primer strand O O 2 Pi base base O H2O - - O O O À P -- P- O O DNA template strand PPi O O: --- P - 0 O DNA template strand base base HO HO 5' 5' 3' Primer strand 3' O base base OH-O 1 2- 0 -- p === O base baseCH2 O B H H H H H H H H O >P-O-CH2 O B / --- 0 H H H H Asp O OH H PP¡ H H P -O / 1 O O Asp Mg2+ P O o O Asp DNA polymerase

Precisión de la replicación

La replicación es muy precisa E. Coli un error cada 109-1010 nucleótidos (cromosoma de 4,6x106 pb)-> un error cada 1000-10000 replicaciones H H / CH3 OIIIH-N N N T N-HIIIN A N N N O H N N-H / H 1 N- C NINH-N G -N N =N OINIH-N H (a) A -N ÎN CH3 T N-HILIO N- OIIIH-N G = N H-N H (b) La tasa de error disminuye gracias a mecanismos enzimáticos adicionales Los puentes de hidrógeno especifican el apareamiento y la geometría común entre bases complementarias. El centro activo de la DNApol acomoda solamente pares de bases con esa geometría Medida in vitro indican error cada 104-105 nucleótidos CH2 O B un Template strand un O H -0-P=0 - CH2 0 B H H OH H N- H-N N-HININ G N- N H C NINH- N N: N H N Mg2+ H Template strand