Genética Biomedicina: Bases metodológicas de los análisis genéticos

Bases metodológicas de los análisis genéticos

Purificación y aislamiento de ácidos nucleicos

La extracción y purificación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular.

Los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversos tipos de muestras: sangre, saliva, tejidos ...

Para después realizar, por ejemplo, análisis específicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

• v Determinar la presencia de mutaciones asociadas a enfermedades genéticas.

Detectar la presencia de ADN o ARN perteneciente a microorganismos o virus.

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Conceptos básicos: Genética molecular

• Estudio de los genes a nivel molecular (nucleótidos)
• Fragmentos pequeños de ADN o expresión de genes
• Incluye aspectos de investigación básica como aplicada

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Purificación y aislamiento de ácidos nucleicos: Materiales y técnicas

• DNA/RNA.
• Purificación a partir de células nucleadas/DNA circulante.
• Diferentes materiales de partida: sangre, saliva, tejidos ...
• También en detección de cargas virales (HIV, Hepatitis C).
• Diferentes técnicas basadas en la solubilidad o precipitación diferencial, o en distintas afinidades a diferentes tipos de matrices.

IGEN QUALITY ASSURANSE RGEN Blood Sample Cell Lysis DNA Binding Wash Elution

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Etapas de extracción y purificación de ADN

Etapas básicas de un procedimiento general para Extracción y Purificación de ADN

1. Disgregación o fragmentación del tejido
2. Lisis celular

Estas etapas deben ir acompañadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares

1. Clarificación
2. Purificación

1

1. Resuspensión y almacenamiento

Cualitativo: electroforesis

1. Análisis

Cuantitativo: espectroscopia UV

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Durante todo el procedimiento se deben usar soluciones y materiales libre de nucleasas (en general esterilizado), además de guantes Blood Sample Cell Lysis DNA Binding Wash Elution

Componentes de una solución de lisis

Amortiguador de pH 7-8 (buffer) Detergentes: SDS, Triton: desestabilizan las membranas biológicas liberando el contenido celular Ácido Etilen Diamino Tetracético (EDTA): Quelante de Mg2+ -> inhibe acción de nucleasas durante la extración/purificación. Agentes caotrópicos: sustancias que desorganizan la estructura tridimensional de macromoléculas (proteínas, ADN, ARN) y las desnaturaliza. Ejemplos: urea, tiourea, sales de guanidinio. Enzimas líticas (Lisozima, liticasa,): favorecen la lisis de paredes celulares o membranas

Blood Sample Cell Lysis

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Clarificación y purificación del ADN

3. Clarificación. Eliminación de restos celulares

• Centifugación
• Filtración
• Método mixto: filtración + centrifugación

V 1 O =

Blood Sample Cell Lysis DNA Binding

4. Purificación

• Para evitar que sales u otros solutos queden atrapados en ADN, se lava con etanol 70%
• Concentración del ADN: Precipitación con Alcohol (Etanol 96%)

C > O O

Blood Sample Cell Lysis DNA Binding Wash

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Resuspensión y almacenamiento de ácidos nucleicos

5. Resuspensión y almacenamiento

• Buffer TE: 10 mM Tris-HCI pH 8.0, 1mM EDTA pH levemente básico previene depurinación EDTA quelante de Mg2+: ayuda a inactivar las DNasas
• Almacenamiento: 4℃ por períodos largos/ -20℃ para almacenamiento prolongado
• Evitar congelado-descongelado repetitivo, ya que produce degradación.

C > · C O -

Blood Sample Cell Lysis DNA Binding Wash Elution

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Análisis por espectrofotometría UV

6. Análisis por espectrofotometría Espectro de Absorción UV del ADN: 260nm

0.4 Absorbance 0.3 0.2 0.1 0.0 240 260 280 300 320 Wavelength [nm]

• El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta.
• En el caso del ADN y el ARN, se expone una muestra a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que atraviesa la muestra.
• Una parte de la luz ultravioleta pasará y otra será absorbida por el ADN/ARN. Cuanta más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la misma.

https://www.youtube.com/watch?v=zyh5YqPyhJc

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Determinación de concentración y pureza por espectrofotometría

6. Análisis por espectrofotometría Espectro de Absorción UV del ADN: 260nm

0.5 0.4 Absorbance 0.3 0.2 0.1 0.0 240 260 280 300 320 Wavelength [nm]

El análisis de la absorbancia de una muestra de ADN al espectrofotómetro permite determinar:

• La concentración de ADN/ARN de la muestra
• La pureza de la muestra.

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ADN 260/280 < 1.6: contaminación con compuestos aromáticos 1.8 - 2.0: Pureza óptima >2.1: contaminación con ARN 260/230 - mide la contaminación con sales. 2.0 - 2.2 Pureza óptima 1.5 - 2.2 Pureza aceptable ARN 260/280 2.0 - 2.1 Pureza óptima ≥ 1.8 aceptable 260/230 - mide la contaminación con sales. 2.0 - 2.2 Pureza óptima 1.5 - 2.0 Pureza aceptable

Nucleic Acids Eile Edt Show Context Help Re-blank Print Screen Start Report Measurement complete 8/22/2005 3:34 PM Exit Measure Blank Print Report Show Report User Default 6.75- Sample Type DNA-50 6.00- 5.50- 5.00 Sample ID 4.50 4.00- Batch Index 3.50 2 230 Abs. 2.754 2.50 A-260 10 mm path 6.098 2.00 A-280 10 mm path 3.347 1.00 260/280 1.82 0.50- 0.00- 260/230 2.21 -0.68- 20 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 30 340 350 Wavelength nm 304.9 3.0.0 81596 x. Nucleic Acids Re-blank Print Screen Recording Measurement complete 1/24/2012 11:35 AM Exit Measure Blank Print Report Show Report User Default Overlay control Sample Type RNA-40 2.53 2.40 2.20 2.00 1.80 1.60 10 mm Absorbance 1.40 Sample / 11 1.20 λ230 Abs 1.160 1.00 0.80 A-260 10 mm path 2.290 0.60 A-280 10 mm path 1.117 0.40 0.20 260/280 2.05 0.00 260/230 1.97 -0.25- 20 230 240 250 260 270 280 200 300 310 320 30 340 350 Wavelength nm ng/uL 91.6 3.3 B2858 -014/80/16 Clear graph each Sample 3686 Sample 5 10 mm Absorbance 0 3.00 1.50 ng/uL

Análisis por electroforesis en gel de agarosa

6. Análisis por electroforesis en gel de agarosa

Permite separar moléculas cargadas de ADN en función de su tamaño y carga. Las muestras de ADN se cargan en pocillos en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel. Las moléculas se desplazaran por el gel en a distintas velocidades con lo que se separan unas de otras. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacarido llamado agarosa

• El gel es una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros.

1 2) 3 4 3 6 I 4 + +

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Procedimiento de electroforesis en gel de agarosa

6. Análisis por electroforesis en gel de agarosa

• Los fragmentos de ADN tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo.
• Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.

1 Preparar el gel de agarosa en el soporte.

2 Retire los tornillos de los sujetadores y el peine, y sumerja el gel en el tampón dentro de la cuba de electroforesis. -) (+) மனித

3 Coloque cada muestra en un pocillo consecutivo. A B C D E F (+)

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4 Cierre la tapa, conecte el enchufe con la fuente de corriente y realice la electroforesis. Después de la electroforesis, transfiera el gel para la visualización. (-) 5 Analice en el transiluminador de luz blanca. - (+)

https://www.youtube.com/watch?v=W_nc1DOqDrl

Visualización y marcadores en electroforesis

6. Análisis por electroforesis en gel de agarosa

• Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular el peso molecular de las muestras de ADN problema.
• La visualización del ADN en los geles se hace mediante tinción con el colorante fluorescente, que tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta.
• Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los marcadores de peso molecular.

- - ADN genómico M 1 2

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