Secuenciación de ADN, paradoja del valor C y genómica comparativa UAQ

Secuenciación de ADN

Dra. Hayde A. Vergara Castañeda Facultad de Medicina, UAQ

1Secuenciación de ADN La determinación del orden o secuencia de nucleótidos de una muestra de ADN.

Método de Sanger

2Método de Sanger J. Mol. Biol. (1975) 94, 441-448 Frederick Sanger A Rapid Method for Determining Sequences in DNA by Primed Synthesis with DNA Polymerase F. SANGER AND A. R. COULSON Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology Hills Road, Cambridge CB2 2QH, England

Secuenciación enzimática por el método de Sanger con Dideoxi DNA

3Secuenciación enzimática por el método de Sanger con Dideoxi DNA (a) 0 O=P-O- I 0 1 O=P-O- O=P-O- 0 1 O=P-O- I Ò CH2 - O base H エ · H H 3' OH · エ Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) CH2 - O base エ - H H H 3' H H (b) o- I O=P-O- I O I I O=P-O- I O Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)

Biosíntesis de desoxirribonucleicos

4Biosíntesis de desoxirribonucleicos Base N N Tiorredoxina (SH2) 0-P-O. N N 0 NADP+ H H H H OH OH Ribonucleótido reductasa Base N N 0 N NADPH 0-P-0-CH2 N O Tiorredoxina (S-S) H H H H + H+ OH H proveniente de la vía de las pentosas

5 0 o= CH2 0 Tiorredoxina reductasaPlantilla de ADN Primer o cebador dNTP ddNTP marcados radioactivamente ADN polimerasa Template-3' CTAAGCTCGACT 5' Primer -5'-OH 3' dCTP dTTP dATP dGTP + DNA polymerase + ddATP + ddCTP + dGTP + ddTTP 1 - Template CTAAGCTCGACT GATTCGAGCTGddA GATTCGddA GddA CTAAGCTCGACT GATTCGAGddC GATTddC CTAAGCTCGACT GATTCGAGCTddG GATTCddG ddG GATTCGAGCddT GATddT GAddT A C G T G T A Autoradiogram of electrophoresis gel ₸ T A A G C 5' 3' Sequence of complementary strand Sequence of original template strand

6 300 - 500 nucleótidos 1ª secuenciación - 1977, secuenciación de 5368 bp del genoma del bacteriófago Phi-X174 int U< JUHUU << HUM CTAAGCTCGACT+ ddATP ddGTP ddCTP ddTTP - ACCCTT TGATCCGCGA

Secuenciación Automática

7Secuenciación Automática 5' CCTATTATGACACAACCGCA 3' ddCTP ddGTP ddTTP ddATP c G T A dNTPs Template strand Primer (sequence known) 5'CCTATTATGACACAACCGCA 3' 3'GCGT 5' 5'CCTATTATGACACAACCGCA 3' 3'GGATAATACTGTGTTGGCGT 5' 5'CCTATTATGACACAACCGCA 3' 3' GATAATACTGTGTTGGCGT 5' Primer o cebador Plantilla dNTP ddNTP marcados con fluorocromos ADN polimerasa Hasta 96 capilares mezcla de fragmentos SAAG 5%-AAGC SAAGCG in - 5'AAGCGAT -AAGCGANG ~AAGCGATGT AAGCGATOTT + archivo .ab1 AAGCGAT Laser Electrophoresis GGATAATACTGTGTTGGCGT Longest fragment Shortest fragment Detector 500 - 800 nucleótidos

8 3' GGATAATACT GT GT T GGC GT 5' Movimiento electroforético de la muestra dependiendo de masa/carga LÁSER N DETECTOR1 Alinear Ensamblar - I 3" 3' 5'- .CGTCGCAGCCCCGGA ..... 3' TỪtit-Chromas 0 × Ent Options Help Reverse Enhance ........... ETACARACT € GTTOCCTCOGCOGGATCT SSTOCK cocco primera segunda GTTOCCTCOGCOGGATCT OCCCCGOGTOCGTC ACCAM CCCOCCO primera segunda GASGACCAACCAAAACTC GAGGACCAACCAAAACTC TTTOTATACCCCCTCO TGTATACCCCCTCO COTTTTTTATAATCIGAOCCTT TTATAATCTGAGCCT 135 primera segunda CTCGOCOCCICTCOTAGOCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACOGATCTCTTO CTCOGCOCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACOGATCTCTTO ... 195 340 primera segunda GTTCTOOCATCOATGAAGAACOCASCOAMATOCOATAASTAATOTGAATTOCASAATTCA GTTCTOOCATCGATGAAGAACOCAGCGAAATOCGATAAGTAATGTGAATTOCAGAATTCA 255 primera segunda GTGAATCATCOAATCTTTOMACOCACATTOCOCCCOCCASTATTCTGOCOOOCATOCCTO GTGAATCATCGAATCTTTGAACOCACATTOCOCCCOCCASTATTCTOGCGOGCATOCCTG ... 315 primera segunda TOCOAGCOTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCC0000OSTCOOCOT7600GAYCOOCCCTC TCCSAGCOTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTOGGGATCGGCCCTC 375 primera segunda CCTTAGCOOGTOOCCGTCTCCGAAATACASTOOCOSTCTCOCCOCAOCCTCTCCTOCOCA CCTTAGCGOGTOGCCGTCTCCGAAATACAGTGOCGGTCTCOCCGCAGCCTCTCCTGCOCA ... 435 primera segunda GTAGTTTOCACACTCOCATCOOGAOCOCOOCOCGTCCACAOCCOTTAAACACCCAACTIC GTAGTTTGCACACTCOCATCOGGASCOCGGCGCGTCCACAOCCGTTAAACACCCAA 495 536 primera segunda TOMAATOTTOACC 500 GATC GATC segunda TOCOGABOGAT LACATI GAACOTTACCCAMACT CCAAACT 25 .... .... 5'- .CGTCGCAGCCCCGGA .. ... 3' I

Secuenciación de genomas

9Secuenciación de genomas Las técnicas de secuenciación tradicionales sólo permiten secuenciar cadenas cortas de ADN v Necesitamos una estrategia para fragmentar un genoma y luego reensamblar el genoma secuenciado Las dos estrategias más usadas son: V Whole Genome Shotgun (WGS) sequencing o Para genomas pequeños, los fragmentos no se ordenan en jerarquías V Hierarchical shotgun sequencing Para genomas más grandes, aunque en el fondo bastante similar o V Ambas se basan en la técnica de shotgun para fragmentar las secuencias (fragmentación aleatoria) el disparo de una escopeta (shotgun) lanza fragmentos en una distribución aleatoria

Terminología de secuenciación

10Terminología · BAC (Cromosomas artificiales de bacterias): constructo de ADN que utiliza las propiedades de los plásmidos bacterianos para replicarse. YAC (Cromosomas artificiales de levadura) Fragmento: secuencia contigua de ADN, sin huecos " Contig: conjunto de fragmentos contiguos de los que se puede obtener una ecuend larga. Los contig de NCBI se refieren ya a la secuencia más larga en sí. BAC Contig 1 Contig 2 - Fragment - Read (known sequence) Roughly known length but not known sequence Bacterial F plasmid is cut within lacZ gene with restriction enzymes Gene of interest is cut out using restriction enzyme C F' plasmid and gene of interest ligate más BAC is electroporated into E. coli cells 35 Cells are plated on X-gal/IPTG medium White colonies are composed of transformed lacZ 'cells

Secuenciación aleatoria (shotgun)

11Secuenciación aleatoria (shotgun) 2,000 bp - 10.000 bp - 1. Fragmentación al azar del DNA del genoma (2,000, 10,000 y 50,000 pb). Celera Genomics. 2,000 Base Plasmid Library 10.000 Base Plasmid Library 2. Librerías de fragmentos de por lo menos 3 tamaños diferentes. BAC's

123. Secuenciación extremos de fragmentos clonados. Se decodifican 500 pb de cada extremo de cada fragmento generando millones de secuencias 2.000 bases OGAGOA GOAGGACT CAGA TTAGAGO GGAC 10,000 bases 4. Ensamblaje. Algoritmos informáticos ensamblan los millones de contigs secuenciados en un tramo continuo

Ensamblaje de fragmentos

13Ensamblaje alineamiento contig fragmentos Imageado scaffold genoma de referencia hort DNA equences contig 1 contig 2 contig 3 paired-end reads paired-end reads scaffold sequenced sequenced sequenced Alineamiento y fusión de fragmentos de nucleótidos en una secuencia mayor Tich bullis flap IP Başı 13 MEIN - Inriad. PLATON

Secuenciación jerárquica aleatoria (Clon a clon)

14Secuenciación jerárquica aleatoria (Clon a clon) 150,000 bp 1. Fragmentación aleatoria (shotgun) 150,000 pb Consorcio de 20 laboratorios públicos pertenecientes a 6 países. BAC LIBRARY 2. Bibliotecas en vectores. Clonación de fragmentos BAC's Se almacenan en bibliotecas según su tamaño (jerarquía) fragmentos grandes (100-500kb) cósmidos (~50kb) plásmidos (~2kb)

15Chromosome 3 BAC #1 2 3 4 500 3. Etiqueta de identificación única que determina el orden de los fragmentos. - Las huellas digitales implican cortar cada fragmento de BAC con una sola enzima y encontrar puntos de referencia de secuencia común en fragmentos superpuestos que determinan la ubicación de cada BAC a lo largo del cromosoma. - Sitios de secuencia etiquetada (STS). BAC #1 BAC #200 9 BAC #2 BAC #3 M13 #1 M13 #2 M13 #1 M13 Library 4. Division al azar (1.500 pb) y se coloca en otra pieza artificial de ADN llamada M13

16M13 #1 5. Secuenciación de 500 pb de un extremo del fragmento generando millones de secuencias M13 CAAATA ATACGG GATGGGG GTCATGAT CAAATAACGGTCATGATGGGG BAC #200 Chromosome 3 6. Programa computacional - PHRAP ensamblaje de contigs

17Whole-genome shotgun sequencing Easier/simpler to sequence, hard to assemble b chromosomes Generace bens of milions at sequence mads Plasmids ~4000 bp Reads -500 bp - Assortie Hierarchical shotgun sequencing Harder/more complex to sequence, easier to assemble chromosomes AREPORTAROSTR Construct and select mapped ACTODELAVOCE BACS -150,000 bp TOOCUPATSOCC NTOLATESTAC 200 TETTACHAĞINA EGORER DOGNENT - Plasmids several thousand Reads ~500 bp Assemble Eric Green, Nat Rev Gen (2001)

Secuenciación de Nueva Generación (NGS)

18Secuenciación de Nueva Generación Secuenciación de nueva generación refiere a una nueva y versátil tecnología de secuenciación de ADN que permite ensayos de escalamiento de genomas completos altamente adaptables y de alto rendimiento a un costo razonable y alta precisión. $100,000,000 NGS $10,000,000 Next Generation Sequencing HSegX Ten $1,000,000 10,000 HSeq 2500 Cost/Gibabase $100,000 1,000 $10,000 100 $1,000 10 Gerome Analyzer 1 $10 ABI 3730x 0.1 $1 0.01 2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014 Enormes volúmenes de información a bajo costo Genome Analyzer Ix $100 Gigabase Output/Week

Diferencias: Sanger vs Nueva generación

19Diferencias: Sanger vs Nueva generación Secuenciación Sanger Secuenciación Nueva Generación DNA es fragmentado DNA es fragmentado Adaptadores ligados a fragmentos (construcción de librería) O - Clonación en un vector (plásmido) Amplificación clonal de fragmentos en una superficie sólida (puentes o emulsión) Reacción de secuenciación cíclica Detección directa paso por paso de cada base nucleótidica incorporada durante reacción de secuenciación Separación por electroforesis. Detección con etiquetas fluorescentes MAAAA

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Elementos y etapas de la PCR

20PCR (Polymerase Chain Reaction) Elementos de la PCR · ADN · Enzima DNA polimerasa · Adaptadores de PCR (primers) · Nucleótidos (dNTPs) · Buffer de PCR ATTCOCATC A C Etapas de la PCR 1. Desnaturalización 2. Hibridación o Alineación 3. Extensión 100 Denaturation Temperature 90 (ºC) I 80 1 70 - Extension 60 - 50 - Annealing T T 1 2 3 4 5 6 7 Time (min)

21original DNA to be replicated 5' 3' 5' 3' K I 5' 3' I 3' 5' H 5' 3' 1 1 2 2 3 3 3 5' 1 I 5' 3' 3' 5 DNA primer 3' 5' 3' 5' nucleotide 1 Denaturation at 94-96℃ 2 Annealing at ~68℃ 3 Elongation at ca. 72 ℃

Librería de ADN - nueva generación

22 1 2 3Librería de ADN - nueva generación 1. Fragmentación 5000 Genomic DNA Hydrodynamic shearing Enzymatic (e.g .. Nebulization Fragmentase or lon Xpress) Forced acoustic Ultrasonication shearing X + End repair Blunt-end fragments TI III + Size selection Adaptors 2. Etiquetado 3. Amplificación DNA library 1 Attachment to microbead Attachment to glass slide 1 emPCR Bridge PCR 4. Secuenciación

230000 000 00 00 00 Fragmentation of DNA (sonication or enzymatic) 1000000 2000 00000000000 1000 200000 1000 1000000 Ligation of adapter and primer (or barcode) X0000 200000000 200000 20000000000000 200000000 Size-select the fragments 2000000000000 Library preparation Good fragments : x 000 Adapter Sequence Barcode Primer clasificación reproducible y fiable para la taxonomía integrativa