Estudio de los cromosomas: técnicas de tinción y análisis genético

VII. ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS

-0 Máster en Biología Molecular C CENTRO EUROPEO DE MÁSTERES Y POSGRADOS- Índice

1. Métodos de tinción y bandeo cromosómico 4
2. FISH 5

3. 2.1 Tipos de sondas 5

4. 2.2 Tipos de FISH 5

5. CGH-array 7
6. Aplicaciones del estudio de los cromosomas 8

Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Objetivos

• Conocer las técnicas que permiten el estudio de los cromosomas.
• Entender las aplicaciones del estudio de los cromosomas.

Ideas clave

• El cariotipo es el juego completo de los cromosomas de un individuo, ordenándolos en función de su tamaño, forma y número.
• El estudio de los cromosomas se realiza mediante el bandeo cromosómico, FISH y CGH-array.
• El bandeo cromosómico consiste en la tinción de los cromosomas con colorantes como el de Giemsa (bandeo G).
• El FISH emplea sondas fluorescentes para hibridar con fragmentos espe- cíficos de cromosomas.
• El CGH-array permite hibridar a la vez ADN control y de una muestra problema y comparar su genoma.

Introducción a la citogenética

La citogenética es la parte de la genética que estudia los cromosomas. Se denomina citogenética constitucional al análisis de los cromosomas en células que representan a la línea germinal del individuo, como los linfocitos de sangre periférica. Es decir, estudia los cromosomas tal y como han sido heredados.

El cariotipo es el estudio del juego completo de los cromosomas de un individuo, ordenándolos en función de su tamaño, forma y número. La citogenética clásica se basa en el estudio del cariotipo mediante técnicas de bandeo cromosómico. En la actualidad también se emplean técnicas de citogenética molecular, como el FISH o el CGH-array.

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1. Métodos de tinción y bandeo cromosómico

Para distinguir unos cromosomas de otros se pueden realizar técnicas de bandeo cromosómico. Permite distinguir unos cromosomas de otros mediante tinciones, que darán lugar a bandas transversales más oscuras y más claras a lo largo de cada cromosoma, que se corresponden a los diferentes tipos de cromatina (eucromatina y heterocromatina).

Con el fin de realizar un cariotipo se estudian los cromosomas de una célula en metafase o prometafase. Para ello, hemos de cultivar las células. Generalmente se parte de linfocitos de sangre periférica, aunque pueden utilizarse otras células que contengan núcleo. Se siembran estas células y se induce su división con mitógenos como la fitohemaglutinina. A continuación, se añade colchicina para detener la mitosis en metafase. Se recogen las células y se rompen las membranas celulares con una solución hipotónica (cloruro potásico 0,6%). Después, se fijan las metafases con la solución de Carnoy (metanol: ácido acético glacial 3:1), se lavan los restos celulares y se realiza la extensión en un portaobjetos.

Posteriormente se tiñen. Existen muchos tipos de tinciones para observar los cromosomas. La primera en utilizarse (Carpersson, 1968), fue la de quinacrina o bandas Q, aunque clásicamente la más utilizada es la tinción con el colorante Giemsa (Sumer, 1971).

En el bandeo G, los cromosomas se tratan con tripsina para digerir las proteínas cromosómicas y después se tiñen con la tinción de Giemsa, de ahí su nombre. Cada pareja de cromosomas homólogos presenta un patrón característico de bandas claras y oscuras. Con esta tinción, las zonas ricas en pares de bases A-T dan lugar a las bandas G (más oscuras). Se corresponden con zonas de heterocromatina, que están más compactadas. En el cariotipo humano hay unas 850 bandas G. Las regiones ricas en pares de bases G-C quedan más claras. Se corresponden con regiones de eucromatina, menos compactadas y compuestas, en general, por genes que se expresan activamente. A estas regiones ricas en C-G se las denominó bandas R (reverse) y pueden teñirse con olivomicina (bandeo reverso).

Además de con Giemsa, las bandas G se tiñen con el colorante Hoescht 333258. También se pueden emplear colorantes fluorescentes como la quinacrina, que se une a las regiones ricas en A-T (bandeo Q).

El último paso del bandeo cromosómico consiste en observar por lo menos 20 placas meta- fásicas y formar un cariotipo, donde se colocan los cromosomas por grupos según el tamaño y la localización del centromero. Tradicionalmente se realizaba una fotografía y se colocaban "a mano", pero actualmente se emplean programas de análisis de imagen.

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2. FISH

La hibridación fluorescente in situ o FISH (fluorescent in situ hybridation) es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas. Los cromosomas se hibridan con sondas de ADN complementarias a secuencias determinadas de los mismos, marcadas con un fluoróforo. La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase (poco común).

El protocolo en el caso de células en metafase es sencillo. En primer lugar, se emplea colchicina para parar la división celular. A continuación, se hibrida con la sonda específica marcada con un fluoróforo (método directo). También pueden emplearse sondas de ADN marcadas con moléculas no fluorescentes, que a su vez, serán detectadas con anticuerpos específicos marcados con fluorescencia (método indirecto). Por último, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

2.1 Tipos de sondas FISH

Una sonda es una molécula de ADN complementaria a una secuencia de ADN diana, a la que se va a unir de manera específica. Las sondas pueden marcar para facilitar su detección. En el caso del FISH, las sondas están unidas a un fluorocromo como la rodamina, el FITC o la fluoresceína, que emiten fluorescencia. Comercialmente existen preparaciones de sondas en cuatro colores básicos (rojo, naranja, verde y azul).

Según la región del cromosoma a la que vaya dirigida la sonda, se clasifican en:

• Sondas centromericas: tambien llamadas sondas satélites. Van dirigidas contra el ADN satélite, altamente repetido, de los centrómeros. Son específicas de cada cromosoma.
• Sondas subtelomericas: se unen a las regiones subtelomericas de los cromosomas.
• 7 Sondas de pintado cromosomico (painting): tambien llamadas sondas completas. Consisten en varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma, lo que permite marcar el cromosoma completo.
• Sondas de locus específico: marcan un gen o una región específica de un cromosoma.

2.2 Tipos de FISH

El procedimiento de FISH directo consiste en los siguientes pasos: primero se realiza una extensión en un portaobjetos como en el caso del cariotipo clásico. A continuación, se desnaturalizan los cromosomas y las sondas a alta temperatura, se deshidratan las preparaciones y, finalmente, se incuban las sondas con los cromosomas para que se produzca la hibridación. Después, se lava la preparación, se seca y se añade una contratinción fluorescente. Esta contratinción 5C CENTRO EUROPEO DE MÁSTERES Y POSGRADOS O teñirá el resto del ADN con un color diferente al del fluorocromo de la sonda. Se usa DAPI (azul) e IP (rojo). Finalmente, se observa la preparación al microscopio de fluorescencia.

Existen distintas variantes del FISH: Fiber FISH, FISH inverso, FISH on a chip y FISH espectral o SKY. Por ejemplo, en el FISH en hebra o Fiber FISH, se desproteinizan los cromosomas, de manera que el ADN se extiende linealmente.

El FISH inverso se utiliza para determinar la procedencia de un cromosoma marcador, ya que el ADN problema es el que se marca. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma previamente teñido con Giemsa o marcado con una sonda. Ésto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuación, ponemos los cromosomas de un donante sin anomalías en un portaobjetos y añadimos la sonda preparada. Así, podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida.

EL FISH on a chip, como su nombre indica, emplea un chip en el que hay sondas para todos los cromosomas o para alguna anomalía cromosómica específica.

El FISH Multicolor, M-FISH, FISH espectral o SKY (Spectral Karyotiping) es una adaptación del FISH que permite la visualización simultánea de los 23 pares de cromosomas. Se emplean sondas de ADN marcadas con un fluoróforo específicas para cada cromosoma. Como existe un número limitado de fluoróforos, han de combinarse para generar colores diferentes para cada cromosoma. El procedimiento del FISH espectral consiste en incubar las células en metafase con las sondas, que se unirán a cada cromosoma específicamente. Se observa en un microscopio de fluorescencia y gracias a un programa de procesamiento de imágenes se visualizan cada uno de un color diferente.

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3. CGH-array

El array de hibridación genómica comparada o CGH-array (Comparative Genome Hybridization) se denomina también cariotipo molecular. En el CGH-array, es necesario aislar el ADN genómico, pero no hace falta tener cromosomas metafásicos. Dos muestras de ADN genómico (una de estudio y otra control) se marcan con fluorocromos de distinto color y se hibridan a la vez sobre un porta que contiene miles de sondas que cubren todo el genoma o las regiones que queramos estudiar. El análisis del estudio mediante programas o aplicaciones bioinformáticas permite hacer una comparación cuantitativa de las dos muestras de ADN. De esta forma, compara la fluorescencia de los dos colores. La relación de fluorescencias nos permite detectar las variaciones del número de copias de ADN de los distintos loci (CNVs).

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4. Aplicaciones del estudio de los cromosomas

El estudio del cariotipo permite la detección de anomalías cromosómicas, tanto numéricas o estructurales. Se emplea para el diagnóstico genético (preimplantacional, prenatal o postnatal). En cuanto a las anomalías numéricas o aneuploidías, puede ocurrir que haya más cromosomas de lo normal, como en el caso de las trisomías 13 (síndrome de Patau), 18 (síndrome de Edwards), 21 (síndrome de Down) o del síndrome de Klinefelter (XXY); o que falte un cromosoma completo como en el caso del síndrome de Turner (X0). También son habituales las aneuploidías en las células cancerosas.

Las anomalías estructurales consisten habitualmente en la deleción, traslocación o duplicación de fragmentos más o menos largos de un cromosoma. Así, los individuos con síndrome de Cri-du-Chat presentan un brazo corto en el cromosoma 5. El síndrome de supresión que se da por la pérdida de una parte del brazo corto del cromosoma 1 y el síndrome de Angelman por la falta un segmento del brazo largo del cromosoma 15. También están documentadas anomalías estructurales en casos de cáncer como el cromosoma Filadelfia, habitual en la leucemia mieloide crónica.

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