Xix. Secuenciación del ADN: métodos Maxam-Gilbert y Sanger

SECUENCIACIÓN

-o Máster en Biología Molecular C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS- Índice

1. Método químico de Maxam-Gilbert
2. Método enzimático de Sanger 5
3. Secuenciación automática 6

Secuenciación automática basada en Sanger

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Pirosecuenciación

6

NGS

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Secuenciación de una única molécula de ADN

7

1. Aplicaciones de la secuenciación de ADN 8Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Objetivos de la secuenciación

Comprender los principios de las técnicas de secuenciación. Diferenciar los tipos de secuenciación. Conocer las aplicaciones de la secuenciación.

Ideas clave de la secuenciación

La secuenciación de ADN permite conocer la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN. Las principales técnicas de secuenciación de ADN son la secuenciación química de Maxam-Gilbert, la enzimática de terminación de cadena de Sanger y la secuenciación automática. La secuenciación se emplea para el estudio del genoma (Proyecto Genoma Humano), la detección de mutaciones, el diagnóstico de enfermedades genéticas, la secuenciación de ADNs fósiles, la identificación de especies y el control de cruces entre animales.

Introducción a las técnicas de secuenciación

Las técnicas de secuenciación de ADN permiten conocer la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN. A pesar de que ya existían técnicas para secuenciar pequeños oligonucleó- tidos de forma lenta y muy trabajosa, no fue hasta finales de los años setenta del pasado siglo cuando se publicaron de forma casi simultánea las dos primeras técnicas de secuenciación rápida de ácidos nucleicos: el método químico de Allan Maxam y Walter Gilbert, y el método enzimático de terminación de cadena de Frederick Sanger, S. Nicklen y A. R. Coulson. En 1980, Sanger y Gilbert recibieron el premio Nobel de Química por el desarrollo de la tecnología de secuenciación del ADN. En la actualidad, se emplean secuenciadores automáticos. 3C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

Método químico de Maxam-Gilbert

El método químico de Maxam-Gilbert comienza con la obtención de un conjunto de moléculas de ADN bicatenario marcadas en el extremo 5' con dNTPs que tienen un isótopo radiactivo (generalmente 32P), por la acción de la polinucleótido quinasa. A continuación, cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes químicos utilizados en cada caso son:

• DMS (G)
• Ácido fórmico (A+G)
• Hidrazina (C+T) Hidrazina más sales (C)

De ese modo, se generan una serie de fragmentos, cuyo tamaño comprende desde el extremo marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Como el tratamiento es suave solo se rompe un nucleótido por molécula de ADN, lo que genera moléculas de diferentes tamaños. Los productos de las cuatro reacciones se separan en un gel de poliacrilamida. Se coloca una placa radiográfica para observar el patrón de bandas radiactivas que se forma. Este método permite la lectura de unas 100 bases de secuencia. 4 ọO Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Método enzimático de Sanger

El método enzimático de terminación de cadena de Sanger se basa en el uso de ddNTPs. Como en el caso del método químico, se realizan cuatro mezclas de reacción diferentes. Cada mezcla de reacción contiene:

• ADN a secuenciar: plasmido con el fragmento de ADN "problema" o producto de PCR.
• Los cuatro dNTPs: dATP, dCTP, dTTP y dGTP DNA polimerasa I
• Un cebador marcado radiactivamente o con fluorescencia: oligonucleótido de 17-20 bases complementario al fragmento de ADN que se quiere secuenciar.
• Un ddNTP (a una concentración baja): didesoxirribonucleico, que carece del extremo 3' OH libre, por lo que al incorporarse a una cadena de ADN se para la elongación de la misma.

El ddNTP competirá con su homólogo (dNTP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Así, se obtienen una serie de moléculas de diferente tamaño marcadas en el extremo 5', ya que todas contienen el cebador. Estas moléculas se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-urea. Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se carga en una calle diferente. Se visualizan las bandas de ADN mediante una placa autoradiografía o luz ultravioleta. La secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel. Mediante el método enzimático de terminación de cadena se pueden llegar a secuenciar hasta 500 bases, aunque lo habitual es no superar las 300 bases. 5C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

Secuenciación automática

Secuenciación automática basada en Sanger

Los primeros secuenciadores automáticos de ADN estaban basados en el método de Sanger. Se realizan cuatro reacciones de secuenciación distintas, en cada una de las cuales se añade el cebador marcado con una sonda fluorescente diferente:

• A: JOE (derivado de la fluoresceína), emite en verde. C: FAM (derivado de la fluoesceína), emite en azul.
• G: TAMRA (derivado de la rodamina), emite en amarillo.
• T: ROX (derivado de la rodamina), emite en rojo.

Al terminar la reacción, se realiza una electroforesis (capilar o en gel de poliacrilamida), en la que las bandas pasan a través de un láser de argón, que las excita y emiten fluorescencia. Los resultados se muestran en un gráfico en el que cada pico de fluorescencia representa un nucleótido diferente. Alternativamente se pueden emplear terminadores fluorescentes: se realiza una única reacción de secuenciación en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

Pirosecuenciación

Otra técnica de secuenciación automática es la pirosecuenciación. Permite la determinación de secuencias de ADN a gran escala, empleando luminiscencia. Para esta técnica es necesario:

• eADN a secuenciar: monocatenario Un cebador dNTPs DNA polimerasa
• 3 enzimas: sulfurilasa (y el sustrato adenosina 5'- fosfosulfato o APS), luciferasa (y el sustrato luciferina) y apirasa.

El proceso ocurre en ciclos sucesivos de tres pasos. En el primero se añade uno de los 4 dNTPs. Si es el complementario a la base de la hebra molde que toca copiar, se incorpora a la cadena en extensión por la ADN-polimerasa, liberando un PPi. Este reacciona con APS para dar ATP, que se utiliza para oxidar la luciferasa, proceso en el que emite luz. Si el dNTP que ha sido 6 OO Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos añadido al medio de reacción no es el complementario, es degradado por la apirasa antes de que se añada el siguiente dNTP. La luz emitida es captada por una cámara. Se representan los resultados en forma de pirograma. Esta técnica permite la secuenciación de fragmentos de ADN pequeños y medianos.

NGS

Las técnicas basadas en el método de Sanger son adecuadas para secuenciar fragmentos relativamente pequeños de ADN (hasta 1000 bp), usando vectores de clonación como plásmidos o directamente productos de PCR. Sin embargo, para la secuenciación masiva de fragmentos mayores, como el genoma completo de un organismo, se emplean las llamadas Next generation sequencing (NGS). Son un grupo de técnicas de secuenciación masiva. Emplean otras estrategias. En primer lugar se aisla el ADN a secuenciar, se fragmenta y se clona en un vector de alta capacidad como los BAC (cromosomas artificiales de bacterias). A continuación, se secuencia cada fragmento. Las secuencias se van ensamblando unas con otras hasta obtener la secuencia completa.

Secuenciación de una única molécula de ADN

Por último, citaremos los métodos de secuenciación de una única molécula de ADN, como son el tSMS (True Single-Molecule Sequencing) y la secuenciación SMRT (Single Molecule Real Time Sequencing). Son técnicas empleadas en investigación, que no se utilizan habitualmente en los laboratorios clínicos. 7C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

Aplicaciones de la secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN tiene múltiples aplicaciones. Por supuesto, la primera de las aplicaciones es el estudio del genoma, como el Proyecto del Genoma Humano. Además, se usan en biomedicina para la detección de mutaciones, tanto conocidas como no descritas anteriormente, y para el diagnóstico de enfermedades genéticas. En otros campos de la biología se emplea para la secuenciación de ADNs fósiles, para la identificación de especies y para el control de cruves entre animales. 8 o̧