Interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas, apuntes universitarios

Interacciones entre Ácidos Nucleicos y Proteínas

La mayoría de las proteínas de las que vamos a hablar son factores de transcripción. Es decir, influyen directamente sobre la funcionalidad del DNA. Así, lo importante es el reconocimiento entre las moléculas proteicas y las secuencias de DNA.

El DNA presenta millones de secuencias formadas por sólo 4 moléculas, sin embargo, las secuencias dianas son extremadamente específicas a pesar del pequeño número de bases que participa en ellas. Los factores de transcripción se unen a estas secuencias diana. Los componentes estructurales añaden especificidad a las secuencias para que no tengan que ser muy largas para ser únicas, así, la estructura de DNA puede ser plástica o dar lugar a una estructura no estable, pero con un entorno muy específico.

La unión de estos factores a sus correspondientes secuencias diana está determinada por sus constantes de afinidad (muy elevadas). En esta unión intervienen dos factores de reconocimiento:

• Reconocimiento estructural o docking: El DNA debe reconocer o unir lo más posible un factor de transcripción concreto. Este permite el acercamiento suficiente como para que se formen los enlaces necesarios que mantendrán las dos moléculas unidas.
• Reconocimiento por uniones específicas o Probing: se producen las uniones químicas específicas, generalmente por puentes de hidrógeno, que mantienen unidos ambos elementos.

Técnicas de Estudio de la Unión DNA-Proteína

La secuencia de DNA adopta una determinada estructura, la cual será reconocida por el factor de transcripción de forma específica. Existen diferentes técnicas de estudios que nos permiten comprobar el tipo de uniones que existen entre ambas moléculas, estas se pueden diferenciar en cuatro grandes grupos.

• Difracción de Rayos X: Nos permite aislar las proteínas antes de la unión, mientras están unidas o tras separarse, así podemos apreciar cómo se modifica la estructura de la proteína por la unión. Lo que observamos son unos cristales formados por la unión de la secuencia de DNA y su correspondiente factor de transcripción.
• Gel de retardo: Se utiliza para conocer cuál es la secuencia de DNA a la que se une la proteína, se basa en un gel de proteínas por donde corren de terminados factores de transcripción (pueden estar marcados por radiactividad, sondas fluorescentes, etc). En los pocillos se añaden el fragmento de DNA, de forma que la molécula correrá según su peso, excepto en el pocillo en el que se encuentre su factor de transcripción. En ese caso, ambos se unirán, aumentando su peso molecular y, por tanto, retardándose su banda en la electroforesis
• Impresión de huella proteica o fingerprint: En una secuencia 5' -3' con su región promotora y su región codificadora, que dará lugar a la secuencia de aminoácidos. La región promotora puede estar formada por muchos pares de bases, aunque no todos ellos aparecen de forma activa (no todos son necesarios para el reconocimiento de las polimerasas). Sólo algunos pb específicos son los que intervienen en este reconocimiento. Así pues, si secuenciamos este DNA (una vez unido a las proteínas) encontraremos pb 'protegidos' por las proteínas, estos serán la huella proteica. En una electroforesis ocurriría lo mismo que en el gel de retardo, pues los fragmentos unidos a las proteínas se retardarían, mientras que los demás correrían más rápidamente.
• Biología molecular (generación de secuencias específicas): Consiste en la modificación de las secuencias de bases que queremos estudiar, para así poder observar el fenotipo que estas variaciones impondrán sobre la función de la proteína o el fragmento de DNA que estamos estudiando.

Características de las Proteínas que Reconocen Secuencias Definidas de ADN

La doble hélice de DNA en los organismos eucariotas, se encuentra condensada en una estructura denominada nucleosoma. Los nucleosomas son estructuras circulares formadas por un núcleo proteico (octámero de histonas: H2A, H2B, H3, H4) en el que se enrolla un fragmento de DNA. Además, otra histona externa (H1) fija la microestructura del nucleosoma.

Debido a esta organización del DNA, los factores de transcripción son diferentes en procariotas que en eucariotas. El acceso de los factores de transcripción a las secuencias diana del DNA va a depender de la relación íntima que se establezca entre ambas macromoléculas.

El comportamiento de las proteínas es muy variado, siendo la unión y separación de las histonas la que regula el comportamiento de estos factores. Por ejemplo, en el caso de los factores de transcripción TF3A y TF2D es necesario que la estructura nucleosómica esté totalmente destruida para que se dé el reconocimiento del DNA. En cambio, el reconocimiento del factor GAGA viene determinado por la hidrólisis de ATP, siendo esta energía la que desplaza las histonas de los nucleosomas y deja libre la secuencia diana. Y, por otro lado, también está el caso del MMTV, el cual necesita que la estructura nucleosómica esté intacta para unirse a la secuencia diana.

Otro factor a tener en cuenta es la posible metilación de las bases. Existen muchos genes activos de la zona promotora que pueden ser metilados (istoles GC), cuando esto ocurre se activan factores de inhibición de la transcripción y los genes que los siguen no se transcriben. Por tanto, la metilación regula de forma negativa a la transcripción. Sin embargo, hay muchas excepciones a esta regla, pues existen determinados genes cuya región transcripcional ha de estar metilada para que se dé la transcripción.

Clasificación Estructural de los Factores de Transcripción

Según la estructura de los elementos activos de los factores de transcripción implicados en el reconocimiento de las secuencias diana podemos distinguir varios grupos muy heterogéneos:

Proteínas con Dominio HTH

Esta estructura de hélice-vuelta-hélice está muy extendida, sobre todo en procariotas, aunque también aparece en eucariotas, en homeoproteínas, formando parte de los homeodominios. Fueron descubiertos y estudiados en Drosophila, se vio que estos genes estaban comandados por factores de transcripción cuya estructura era más o menos sencilla. En eucariotas el sistema de regulación de estos factores de transcripción es aparentemente sencillo (hélice-vuelta-helice) pero es más complejo que en procariotas porque usa la combinación de varios sistemas simples.

Su estructura consiste en dos hélices-a empaquetadas entre sí por uniones hidrofóbicas y unidas por un loop corto (4 aa, uno de ellos de glicina). A partir de este loop los primeros aminoácidos de ambas hélices forman el empaquetado que mantiene sus estructuras, pues la glicina permite el giro de las hélices para que se establezcan las uniones hidrofóbicas entre ellas. La segunda hélice entra en contacto con las bases del DNA, normalmente por el surco mayor.

Las relaciones entre proteínas y ácidos nucleicos pueden ser:

• Relaciones específicas: Se unen las proteínas con las bases nitrogenadas. Ocurren en el surco mayor.
• Relaciones inespecíficas: Un determinado aminoácido de la proteína se une al esqueleto azúcar-fosfato. Ocurren en el surco menor

Proteínas con Dominio HTH en Procariotas

Proteína Cro y Represor A

La proteína represora Cro y el represor A (proteína represora e inhibidora) fueron las proteínas con el motivo HTH más estudiadas. Las actuaciones combinadas de estos dos factores de transcripción regulan el comportamiento del fago A.

Los fagos presentan dos ciclos de vida: el lisogénico y el lítico. El paso de la fase lisogénica, que es la primera que tiene lugar cuando se integra el fago en la bacteria, al ciclo lítico se produce única y exclusivamente por el balance de estas dos proteínas.

• Proteína Cro: La estructura de Cro es un homodímero de 66aa por monómero, los cuales forman 3 hélices-a y 3 cadenas-B. Las 3 hélices-a aparecen en el loop que une a dos cadenas-B. Dos de esas hélices-a (la 2 y la 3) aparecen formando el motivo HTH, siendo la hélice 3 es la que realmente entra en contacto con el DNA en el surco mayor. Esta hélice se denomina hélice de reconocimiento.
• Represor A: Está formado por 236 aa y presenta dos dominios, los cuales se pueden separar por proteólisis suave. Uno de ellos con un amino terminal de unión al DNA y el otro con un carboxilo terminal encargado de la dimerización. Esta proteína presenta monómeros de 5 hélices-a, siendo la quinta de estas la que permite la unión entre ellos formando dímeros y la unión a su secuencia del DNA (unión débil).

La diferencia de fuerza de unión en ambas determina el destino del fago, pues estas uniones son determinantes para la transcripción y traducción de los genes en las rutas metabólicas. Este represor presenta muchas similitudes con la proteína Cro.

El diámetro de los dímeros formados en ambos casos es de 34 A, el cual coincide con la longitud de una vuelta de la doble hélice de DNA. Por ello, cuando Cro o el represor À se unen a la secuencia diana de una de las hélices de reconocimiento (hay una en cada monómero del dímero) entra en el surco mayor y la otra, una hélice más allá, en la misma región del DNA (siguiente surco mayor). Ambas regiones están separadas por 10pb entre sí, haciendo que las hélices de reconocimiento reconozcan la mitad de bases de las secuencias en las que van a operar. Para la unión de los dominios HTH con la secuencia diana del DNA se necesitan varias cosas:

• Un dominio HTH que presente una hélice-a que actue como hélice de reconocimiento
• Una secuencia específica de aminoácidos en dicha hélice, la cual sea capaz de reconocer las bases de la secuencia diana
• Interacciones específicas entre los dos monómeros, las cuales den lugar a las distancias relativas y la orientación de estas hélices de reconocimiento dentro del dímero

Con estos datos, el grupo de investigación de Stephen Harrison estudió el fago 434 que actúa de forma similar. En este descubrieron que el DNA cambia su conformación, se curva unos 60°, para acomodarse al dímero, para ello se ensanchan los surcos mayores, donde entran las hélices de reconocimiento, y se estrechan los menores. Debido a esta curvatura, los surcos menores quedan enfrentados a la proteína, pero no se dan interacciones entre ellos. Existen algunas diferencias en las regiones operadoras (secuencias diana) que determinan la afinidad por la proteína Cro y el represor A. Como las secuencias de DNA son palindrómicas, cada mitad de la secuencia de las regiones operadoras entra en contacto con una de las hélices de reconocimiento. L a zona central de la secuencia genera el surco menor, es el que se enfrenta con la proteína. Las hélices de reconocimiento entran en el surco mayor y se unen específicamente.

Una glutamina en posición 28 de la hélice de reconocimiento dará lugar a la primera unión específica por puentes de hidrógeno con los nitrógenos 6 y 7 de la primera adenina de la secuencia diana. La siguiente unión se dará por la glutamina en posición 29, que reconocerá un oxígeno 6 de la guanina en posición 13. En cambio, la tercera unión no es específica por puentes de H, sino que se da por uniones hidrofóbicas producidas por la glutamina 29 y una treonina, las cuales interactúan con el metilo de la timina del siguiente par de bases. Y así, quedan determinadas las tres primeras uniones de la secuencia diana.

Tanto la proteína Cro como el represor À se unen igual a las tres primeras bases de las regiones operadoras, por lo que no debería de haber diferencias significativas en sus constantes de afinidad, pero si las hay. Esto se explica por el cuarto par de bases, y sobre todo por la estructura que se genera en el DNA tras la unión del primer aminoácido de la proteína.

Tras la unión de los dímeros a los operadores, la configuración DNA-PROTEÍNA hace que la otra mitad de la región operadora adquiera una determinada conformación. Cada una de las subunidades se fija al surco mayor por uniones de los grupos amino de la cadena principal al esqueleto azúcar fosfato.