Unidad Didáctica 3: Preparación de medios para el cultivo de microorganismos

Objetivos del Cultivo de Microorganismos

UNIDAD DIDÁCTICA 3: PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS Y TÉCNICAS DE INOCULACIÓN, AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

Metas de la Unidad Didáctica

Objetivos:

• Clasificar los medios de cultivo más utilizados en microbiología clínica.
• Conocer los componentes de un medio de cultivo.
• Seleccionar el material y preparar los medios de cultivo sólidos y líquidos.
• Realizar la esterilización y la comprobación de la esterilidad de los medios de cultivo, así como su correcto almacenamiento.
• Aplicar las diferentes técnicas de aislamiento, siembra, incubación y recuento de m.o.

Introducción al Cultivo Microbiano

Crecimiento de Microorganismos

Introducción al cultivo de m.o: crecimiento microbiano. De forma general, para la determinación de la presencia de un m.o en una muestra es necesario su cultivo. Es decir, se debe proporcionar al m.o las condiciones ideales para su multiplicación (crecimiento). De esta forma se obtiene un número suficiente de células que permite:

• Determinar la presencia/ausencia de m.o y hacer un recuento de los mismos.
• Identificar m.o.
• Determinar la sensibilidad a antibióticos.

Materiales para el Cultivo

El elemento principal para el cultivo de m.o es la placa Petri, las cuales se rellenan con el medio de cultivo de tipo sólido, se siembran y se incuban. También se pueden realizar cultivos en medio líquido. Para ello, se pueden emplear diversos materiales de laboratorio como tubos de ensayo o matraces. Para cada m.o es necesario la adecuación del medio de cultivo y de las condiciones de incubación.

Diseño y Tipos de Medios de Cultivo

Composición General de Medios de Cultivo

Diseño y tipos de medios de cultivo. En la actualidad, existe una gran variedad de medios de cultivo disponibles en el mercado, por lo que su diseño no suele ser habitual. Esta función suele darse en mayor medida en los laboratorios de investigación. Un medio de cultivo se diseña en base al m.o que se quiere cultivar y de la determinación que se vaya a llevar a cabo. En términos generales, todos los medios de cultivo están compuestos por:

• Una base mineral en la que se encuentran los nutrientes inorgánicos que pueda necesitar el m.o:
  1. Macronutrientes: suelen ir incluidos en la composición (K, Mg, Ca o Fe).
  2. Micronutrientes: aparecen como elementos traza (Mn, Co, Cu o Zn).
• Una suplementación de la base mineral con:
  1. Fuente de C.
  2. Fuente de N.
  3. Fuente de S.o
  4. Factores de crecimiento.

Constituyentes Adicionales en Medios de Cultivo

Además, en los medios de cultivo se utilizan una serie de constituyentes para su diseño:

• Un agente gelificante para dar solidez al medio:
  • Agar: polisacárido que licúa cuando alcanza los 100 ºC y se gelifica sobre los 40 ºC. Es el gelificante más empleado debido a su propiedad de histéresis térmica. Gelifica cuando baja a los 40ºC aproximadamente. Pero una vez ha gelificado, debe alcanzar una Tª de entre 75-80ºC para volver a un estado líquido (permite incubaciones).
  • Gelatina: tiene naturaleza proteica (colágeno de animales).
• Extractos: de origen animal, vegetal o fúngico. Se emplean como fuente de alimento rica en carbohidratos, proteínas, vitaminas y minerales.
• Carbohidratos: se utilizan como fuente principal de C y energía.
• Sangre, suero o plasma: aportan hormonas y factores de crecimiento. Se emplean para la detección de reacciones hemolíticas (sangre) y de la actividad coagulasa (plasma).
• Peptonas: son el producto de la digestión de las proteínas. Ricas en aa y péptidos (fuente de N).
• Amortiguadores e indicadores de pH: permiten el crecimiento óptimo del m.o de interés y detectar variaciones de pH en el medio.
• Bilis y sales biliares: se utilizan para inhibir el crecimiento de Gram +.
• Agentes reductores: se emplean para el crecimiento de m.o microaerófilos o anaerobios (cisteína).
• Colorantes: se emplean como inhibidores de crecimiento de un determinado grupo de m.o.

Clasificación de Medios de Cultivo

Clasificación por Consistencia Física

Los medios de cultivo se pueden clasificar en función de:

• Su consistencia física:
  1. Caldos o medios líquidos.
  2. Medios sólidos: misma composición que los líquidos, y se añade un gelificante.
  3. Medios semisólidos: consistencia intermedia. Se emplean para observar movilidad.

Clasificación por Composición Química

• Su composición química:
  1. Medios definidos/sintéticos: se conoce exactamente la composición y proporción.
  2. Medios complejos: no se conocen con exactitud la proporción de cada nutriente, ya que es una mezcla que generalmente posee extractos.
  3. Medios enriquecidos: medios complejos que se les anaden nutrientes complementarios como sangre o albúmina.

Clasificación por Función

• Su función:
  1. Medios generales: permiten el crecimiento de una gran variedad de m.o.
  2. Medios diferenciales: contienen reactivos que permiten distinguir unos m.o de otros en función de su crecimiento en dicho medio (Agar McConkey).o Medios selectivos: permiten el crecimiento de un determinado grupo de m.o pero no de otros (Agar Manitol Salado).
  3. Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado grupo de m.o, pero sin inhibir completamente el crecimiento de otros. Poseen algún componente que favorece el crecimiento del m.o deseado, aumentando su proporción.

Medios de Cultivo y su Utilidad

Relación entre Consistencia, Recipiente y Utilidad

Consistencia Recipiente Utilidad Aislamiento Placa Petri Estudio de características Recuentos, etc. Sólido En tubo inclinado (slant o pico de flauta) (Figura 3.6) Aumento de la superficie de siembra en aerobiosis En matraz o frasco Obtención de gran cantidad de biomasa Estudio de características específicas Líquido En tubo Obtención de biomasa Estudio de características específicas Semisólido En tubo Medios de cultivo según consistencia relacionados con el recipiente de uso y su utilidad.

Medios Específicos y sus Aplicaciones

• Agar McConkey: medio selectivo y diferencial para enterobacterias. Contiene sales biliares y cristal violeta, que inhibe el crecimiento de Gram + y muchas Gram - no entéricas. Permite diferenciar las bacterias que fermentan lactosa (único carbohidrato en el medio) de las que no, ya que también contiene un indicador de pH. Las bacterias fermentadoras acidifican el medio y forman colonias de diferentes tonos de rojo. Las que no fermentan aparecen como colonias transparentes.

Escherichia coli Enterobacter aerogenes 1 Lactose fermenting colonies 1 Non-lactose fermenting colonies Proteus vulgaris Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus PINK COLORLESS MacConkey's Agar Estudio de movilidad Medio de cultivo McConkey con inoculaciones de diferentes enterobacterias.

• Brain Heart infusión: medio complejo utilizado para el crecimiento de numerosos m.o (bacterias y levaduras).

. Agar Mueller-Hinton: medio utilizado para determinar la sensibilidad a antibióticos.

• Agar Hektoen enterico: medio utilizado para el aislamiento de enterobacterias, especialmente Salmonella y Shigella spp. Contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de las bacterias Gram + y Gram - no entéricas. Posee azul de bromotinol y fucsina ácida como indicadores de la fermentación y citrato de hierro como un indicador de la formación de dihidróxido de azufre a partir del tiosulfato.

Cultivo de Salmonella thyphimurium en medio Hektoen enterico.

• Agar Levine: medio utilizado para el aislamiento de enterobacterias (inhibe crecimiento de Gram +). Se utiliza para la diferenciación de Scherichia coli (E.coli) que, en este medio, adquiere un color verde-negruzco metálico.

Cultivo de E.coli en agar Levine.

• Agar CLED: medio de cultivo utilizado para el crecimiento de m.o patógenos en muestras de orina. Este medio impide el desarrollo indebido de Proteus spp.

GRASO® Cultivo de E.coli en agar CLED.

. Agar Luria-Bertani: medio de enriquecimiento ampliamente utilizado para el cultivo bacteriano, especialmente de E.coli.

• Bilis esculina: es un medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento y diferenciación de enterococos. Posee bilis (inhibición Gram +) y esculina, que es hidrolizada por las enzimas producidas por los enterococos y reacciona con el citrato férrico del medio, produciendo un compuesto negro/marrón oscuro.

Figura 3. Hidrolisis de escuina, Cultivo de enterococos en medio Bilis esculina (izq.) y comprobación de hidrolisis de esculina en medio líquido (der.).

• Manitol salado (MSA): medio selectivo utilizado para la detección y aislamiento de estafilococos y diferenciación entre especies de coagulasa + y coagulasa -. Posee una alta concentración de sal que evita el crecimiento de la mayoría de las bacterias de otros géneros, y un indicador de pH (rojo fenol). Los estafilococos coagulasa + pueden utilizar el manitol, variando así el pH del medio (las colonias cambian a un color amarillo). Los estafilococos coagulasa - permanecen de color rojo.

Uninoculated Staphylococcus epidermis Staphylococcus aureus Cultivo de estafilococos coagulasa + (amarillo) y coagulasa - (rojo) en medio MSA.

• Agar DNasa: es un agar con alto contenido en ADN. Debido a la relación entre la presencia de coagulasa y DNasa, este medio es selectivo de m.o coagulasa + como Staphylococcus aureus (S.aureus). S. aureus rompe las cadenas de DNA por la acción de la enzima DNasa. Tras haber cultivado la placa esta se inunda con ácido clorhídrico, provocando que el ADN todavía intacto se vuelva opaco, por lo que se aprecia una zona transparente alrededor de las colonias DNasa + (S.aureus).

DNase Positive DNase Negative Cultivo de estafilococos DNasa + como S.aureus (der.) y DNasa - (izq.).

• Agar Granada: agar diferencial y selectivo para estreptococos del grupo B. Es muy utilizado para aislar Streptococcus agalactiae procedente de muestras clínicas. En este medio S. agalactiae crece de color amarillo-naranja.

Cultivo de estreptococos del grupo B (S. Agalactiae) en medio agar Granada.

• Agar Columbia: es un medio de uso general. Se puede suministrar con un 5% de sangre de carnero que permite detectar reacciones de hemólisis (rotura de los glóbulos rojos), además de suministrar factores de crecimiento de algunas especies patógenas, por lo que se suele utilizar como medio de siembra inicial (no para muestras de orina). También se le puede añadir antibióticos para hacerlo un medio selectivo para estreptococos, estafilococos y enterococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias.

Crecimiento de S. agalactiae y E. fecalis en agar Columbia CNA con 5% de sangre de carnero (región roja) y agar Granada (región blanco-amarillenta). Las colonias de S. agalactiae se aprecian amarillas a la derecha y rojas en la izquierda, mientras que las colonias de E. fecalis se observan blancas en ambas partes.

. Agar Digalsky: medio selectivo para el aislamiento de enterobacterias y otras Gram -.