Historia de la Terapia Génica: experimentos y desarrollo

Línea del Tiempo de la Terapia Génica

TEMA 2: HISTORIA DE LA TERAPIA GÉNICA

LINEA DEL TIEMPO DE TERAPIA GÉNICA

Principio de transducción

Primer ensayo clínico

Primera aplicación de TG aprobado por la Identificación del ARN interferencia

1928 1944 1962 1980 1996 1999 1900 2000 1952 1953 1970 1990 1998

Identificación del "agente transformador"

1ª Transferencia genética a células humanas

Primer ensayo clínico de TG (no aprobado)

Primera muerte Nucleasas con atribuible a la TG dedos de zinc

Principio de transformación

China aprueba el primer fármaco basado en TG

Primer producto basado en terapia génica aprobado por la EMA

Nacimiento de dos niñas editadas genéticamente

2010 2016 2019 2003 2000 2023 2012 2018

Proyecto del genoma humano completado

Desarrollo Desarrollo Desarrollo de de TALENs de CRISPR/ editores de base Cas

Desarrollo de editores de calidad

Estructura ADN

FDA

Principio de Transformación: Experimento de Griffith (1928)

1928: Griffith F., 1928. The significance of pneumococcal types -> PRINCIPIO DE TRANSFORMACIÓN

En 1928 Frederick Griffith, fue un bacteriólogo británico, investigando una enfermedad infecciosa mortal y vírica, la neumonía, publicó en 1928 un artículo en el que estudiaba las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus pneumoniae que producía la enfermedad y otra que no la causaba.

La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cápsula (también se la conoce como cepa S, del inglés smooth (lisa), que es el aspecto de la colonia en las placas petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto de la colonia en la placa de Petri) no tiene cápsula y no causa neumonía.

Griffith inyecto las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo hacía. Luego comprobó que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba neumonía cuando se la inyectaba. Sin embargo, cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva e inyectaba la mezcla a los ratones, los ratones contraian la neumonía y morían; en la sangre de estos ratones muertos Griffith encontró neumococos vivos de la cepa S. Es decir que en las bacterias S muertas había "algo" capaz de transformar a las bacterias R, antes inocuas, en patogenas y este cambio era permanente y heredable.

Frederick Griffith fue capaz de inducir la transformación de una cepa no patogena Streptococcus pneumoniae en patogena. Griffith postuló la existencia de un factor de transformación como responsable de este fenómeno.

Resultados de los Experimentos de Griffith

DesarrolloIndica que resultado obtuvo en cada uno de sus experimentos

• Bacterias S vivas: muere
• Bacterias R vivas: vive
• Bacterias S muertas: vive
• Bacterias S muertas + bacterias R vivas: muere

Identificación del Agente Transformador por Avery, Macleod y McCarty (1944)

1944: Avery, Macleod y McCarty identificaron el agente transformativo

Tras el experimento de Griffith muchos investigadores se centraron en estudiar el "factor de transformación". Los investigadores Oswald Avery, Colin Macleod y Maclyn McCarty hicieron casi exactamente lo que Griffith había hecho en sus experimentos, pero con los siguientes cambios. Primero, después de matar con calor la variedad S de las bacterias, separaron la mezcla en cuatro tubos de prueba. Por consiguiente, cada uno de los tubos de prueba contendría el "agente transformador" desconocido. Se añadió una enzima diferente a cada tubo, excepto a un tubo control que no recibió nada. A los otros tres tubos añadieron por separado cada una de las siguientes enzimas:

• RNAasa, una enzima que destruye ARN
• Proteasa, una enzima que destruye proteínas
• DNasa una enzima que destruye ADN

La teoría detrás de este experimento era que, si el "agente transformador" era, por ejemplo, proteína, ésta sería destruida en el tubo de prueba que contenía la proteasa, pero no en los otros. Por lo tanto, independiente de lo que fuera el "agente transformador" el líquido en uno de los tubos no podría transformar la variedad de la neumonía S. Cuando hicieron esto, el resultado fue muy claro. El líquido de los tubos que recibió las enzimas xxxxxxxxxxxxxx todavía podía transformar la variedad R de la neumonía en la variedad S. Sin embargo, el líquido que fue tratado con la enzima xxxxxxx perdió completamente su habilidad para transformar las bacterias.

Bacterias de tipo IIIS (virulentas)

1 El calor mata a las bacterias virulentas, se homogeneiza y se filtra.

Filtrado de bacterias de tipo IIIS

2 Las muestras se tratan con enzimas que destruyen las proteínas, el RNA o el DNA.

RNasa (destruye al RNA)

Proteasa (destruye a las proteínas)

DNasa (destruye el DNA)

+

3 Las muestras tratadas se agregan a los cultivos de bacterias de tipo IIR

Bacterias de tipo IIR

Bacterias de tipo IIR

Bacterias de tipo IIR

Análisis de Cultivos y Enfermedad

¿Cuál de los tres cultivos sería capaz de producir enfermedad en el ratón? ¿ Los tratados con RNAsa, proteasa o DNAsa?

Los tratados con proteasa y con RNAsa

PROTEASA RIVAsa DNAsa CONTROL

R 5 R S R S R S

SÍ ENFERMEDAD SI ENFERMEDAD NO ENFERMEDAD MUERE

Gracias a este experimento se identificó por primera vez que el DNA es quien pasa información entre unas cepas y otras.

El Principio de la Transducción (1952)

1952: El principio de la transducción

Pressure/suction alternately applied

Strain LA-2 (phe" trp+ met his")

Strain LA-22 (phe trp met+ his+)

Plate on minimal medium and incubate

Medium passes back and forth across filter; cells do not

Plate on minimal medium and incubate

No growth (no prototrophs)

En 1951, Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban investigando la transferencia de genes entre bacterias. Mezclaron dos cepas de Salmonella, cada una con un juego distinto de marcadores genéticos y obtuvieron recombinantes.

Descartaron que se tratara de transformación, ya que los resultados eran similares si añadían DNAasa a las cepas. Descartaron la conjugación ya que realizaron el experimento en un tubo con forma de "U" con una membrana separando los dos brazos de la U, en cada uno de los cuales se colocaba una de las cepas. La membrana impedía el paso de bacterias y los contactos intercelulares directos entre las dos cepas, pero sí que compartían el medio de cultivo.

Growth of prototrophs (phe" trp" met his")

Por experimentos independientes se sabía que una de las dos cepas de Salmonella producía un fago (llamado P22). Con una serie de ensayos se demostró que era precisamente este fago el responsable de producir cepas recombinantes y se postuló el principio de la transducción. Este descubrimiento fue de fundamental importancia ya que explicaba como las bacterias incluso de diferentes especies podrían ganar resistencia al mismo antibiótico. El hecho de que los bacteriófagos podían transferir material genético fue un fenómeno que en seguida se trató de encontrar beneficio como herramienta en biología molecular.

A grandes rasgos, en este experimento se han empleado 2 cepas de Salmonella, donde se veía transferencia de genes entre ambas cepas. Teniendo en cuenta el experimento anterior, se esperaba que al añadir DNAsa dejara de ocurrir, pero no fue así. De este modo, se vio que no era el DNA quien pasaba la información de una cepa a otra. Tras este ensayo, se llegó a la conclusión que el fago era el encargado de pasar la información genética entre ambas cepas. Se demostró que los virus eran los encargados de transportar la información genética.

Resultados de la Transducción

¿Qué ocurriría si el medio se trata con DNAsa? Sí que había transferencia

¿Qué ocurriría si el tamaño del filtro es menor que el tamaño de un bacteriófago? No había transferencia

Básicamente, había dos cepas de Salmonella y se veía transferencia de genes entre cepas, se pensaba que si se añadía DNasa, dejaría de ocurrir, pero no fue así, demostrando que el DNA no era quien pasaba la información entre cepas. No obstante, se vio que el responsable de esto eran los fagos (virus), quien eran los transportadores de información genética.

Estructura del ADN (1953)

1953: Estructura DNA (Watson, Crick y Rosalind Franklin)

Implicaciones genéticas de la estructura del ácido desoxirribonucleico.

El Gen HPRT: Primera Transferencia a Células Humanas (1962)

1962: El gen HPRT, el primer gen transferido a células humanas

En primer lugar, Dihidrofolato reductasa (DHFR) es una enzima necesaria para sintetizar de nuevo ácidos nucleicos. Aminopterina es un compuesto presente en el medio HAT que inhibe DHFR. En este caso la célula activa la ruta secundaria que implica al enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HRPT) y permite la supervivencia y replicación celular.

Waclaw Szyblaski publicó el primer trabajo documentado de transformación genética humana donde se corregía un defecto metabólico. Szybalski utilizó dos tipos de células: unas que poseían la capacidad de sintetizar la enzimaHRPT+ y las otras carecían de dicha capacidad (HRPT-). Esta enzima sintetiza purinas de novo a partir de ADN degradado en las células. De esta forma, Szybalski usó cultivos celulares de médula ósea humana con el medio HAT que contenía aminopterina. La aminopterina es una sustancia que evita la síntesis de novo de purinas inhibiendo la dihidrofolato reductasa (DHFR). La DHFR es necesaria para la proliferación celular debido a que las células lo emplean para sintetizar ácidos nucleicos. Las células incapaces de utilizar DHRF en los medios con aminopterina debían recurrir a la vía alterna de la enzima HGRPT, la cual utiliza como fuente de purinas la timidina presente en el medio HAT. Por esta razón, las células carentes de la enzima HRPT morían en dichos cultivos al ser incapaces de sintetizar ADN. Consecuentemente, las células HRPT+ eran las únicas supervivientes.

Una vez finalizada esta primera etapa del experimento, Szybalski aisló el ADN de las células HRPT+ y lo usó para transformar a las células HRPT -. Después de realizar dicha transformación, las células HRPT- eran capaces de formar colonias y de incorporar ADN de células donantes en sus propios genomas. Adicionalmente, estas células pasaban el ADN incorporado a células hijas en división. Así, las células transformadas podían sobrevivir y reproducirse en los medios HAT. Con esto se demostró que los defectos genéticos en los organismos pueden ser resueltos con la transferencia de ADN funcional proveniente de células sanas y que además éstos pueden ser heredados.

Resultados Esperados en las Condiciones del Experimento

¿Cuáles son los resultados esperado en cada una de las condiciones?

A B

D985 D985

DNA

D98S (HRPT-)

D985 (HRPT*)

D98S (HRPT-)

D985 (HRPT * )

HAT-medium HAT-medium HAT-medium HAT-medium

O O o

Muerte Proliferación Proliferación Proliferación

Primera Aplicación de Terapia Génica (1970)

1970: Primera aplicación de Terapia génica

Rogers y Terhegen fueron los primeros en transferir un gen en un paciente con un objetivo terapéutico mediante un virus.

El primer intento de terapia génica en pacientes humanos comenzó con una observación fortuita. En 1959, el médico Stanfield Rogers estaba trabajando con el virus Shope papilloma, que provocaba verrugas en la piel de los conejos. Publicó en la revista Nature que la piel de estas verrugas contenía niveles anormalmente altos de arginasa, una enzima que descompone el aminoácido arginina. Luego descubrió que algunos científicos que habían trabajado con este virus habían disminuido los niveles de arginina en la sangre.

En paralelo, The Lancet publicó un artículo de Terheggen en el que se identificó una nueva enfermedad genética en dos niñas que sufrían retraso mental. Las pruebas mostraron que tenían altos niveles de arginina, mientras que se detectó muy poca enzima arginasa (deficiencia de arginasa).