Técnicas de extracción de ácidos nucleicos en Biología

Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

Unidad 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos Biología molecular y citogenéticaÍndice Biología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

• 4.1. Muestras
• 4.2. Fundamento de las técnicas de extracción
  • 4.2.1. Lisis celular
  • 4.2.2. Inactivación de nucleasas
  • 4.2.3. Purificación de ácidos nucleicos
• 4.3. Técnicas manuales de extracción de ADN
• 4.4. Kits de extracción de ADN
• 4.5. Sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos
• 4.6. Técnicas de extracción de ARN
• 4.7. Cuantificación y calidad del ADN extraídoBiología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

Introducción a la extracción de ácidos nucleicos

En esta unidad comenzaremos a tratar las técnicas de biología molecular aprendien- do a obtener el material con el que traba- jaremos, los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Comenzaremos la unidad adquiriendo una sencilla base sobre las muestras a partir de las cuales podemos obtener ácidos nu- cleicos y conociendo el proceso general por el que se obtenemos ADN y ARN. Una vez adquirida esta base, dedicare- mos la mayor parte de la unidad apren- diendo a procesar muestras para obtener ADN o ARN, indicando protocolos con- cretos de laboratorio en cada caso. Para concluir la unidad, dedicaremos un punto a la determinación de la calidad de las muestras de ácidos nucleicos para su análisis.

Objetivos de la unidad

Al finalizar esta unidad

• Aprenderemos a extraer ADN y ARN de muestras biológicas complejas.
• Conoceremos los fundamentos de- tras de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos.
• Seremos capaces de aplicar protoco- los para extraer ADN o ARN de ma- nera específica, descartando otros componentes presentes en la mues- tra original.
• Aprenderemos cómo funcionan los sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos.
• Seremos conscientes de la impor- tancia de trabajar con muestras de pureza óptima y aprenderemos los parámetros a través de los cuales la medimos en muestras purificadas de ácidos nucleicos.

( 3Biología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

4.1. Muestras para análisis

Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son moléculas clave para el desarrollo de la vida, por lo que, en principio, podemos encon- trarlos en todas las células que forman parte de los seres vivos. A pesar de ello, existen células que carecen de núcleo (como los eritrocitos) y por tanto no son una buena fuente de ADN. Además de esto, debemos tener en cuenta que ciertas células tienen estructuras y sustancias que pueden hacer más difícil su extracción, por lo que no todas las muestras tienen la misma calidad para la extracción de ácidos nucleicos. Entre la gran variedad de muestras que pueden ser utilizadas para realizar análisis de ácido nucleicos, destacan las siguientes:

• Sangre total: Son muestras de sangre recogidas de ma- nera rutinaria a las que se han añadido compuestos para evitar la coagulación. Son las más usadas en el estudio del ADN por su calidad.
• Sangre seca: Se utilizan cuando el volumen disponible es mínimo y, a pesar de que las células presentes es- tán muertas, sus ácidos nucleicos están poco alterados. Suelen usarse para estudios genéticos neonatales.
• Tejidos frescos o congelados: Muestras de tejido obte- nidas por biopsia. Este tipo de muestras son importantes para el estudio de tumores ya que permiten determinar si existen alteraciones genéticas.

Imagen 1. Las aplicaciones clínicas de los estudios de ácidos nucleicos son cada vez más amplias y es es- perable que en los años venideros sustituyan a algunas técnicas tradicionales. « 4Biología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

• Tejidos parafinados: Son tejidos procesados en los labora- torios para quedar incluidos en bloques de parafina (nor- malmente para estudios anatomopatológicos). Para su uso será necesario tratar la muestra para eliminar la parafina.
• Enjuagues o raspados bucales: Son mezclas que con- tienen células desprendidas de las mucosas de la boca. Estas muestras son también muy utilizadas por no re- querir métodos invasivos para obtenerlas.
• Fibroblastos fetales: Son células que se obtienen del líqui- do amniótico o las vellosidades coriales. Son las principales muestras utilizadas en diagnósticos genéticos prenatales.
• Células procedentes de embriones: Son células extraí- das de embriones obtenidos in vitro para el estudio de su ADN. Estas muestras son cada vez más utilizadas en procesos de reproducción asistida para realizar diagnós- ticos genéticos preimplantacionales.
• Fluidos corporales: Algunos fluidos como el semen, la saliva o la orina contienen células en suspensión a partir de las cuales se puede extraer el ADN. En algunos casos como la orina las células son escasas, por lo que su va- lidez es limitada.
• Muestras forenses: Muestras menos habituales en los hospitales, pero de gran importancia en procesos lega- les. Normalmente proceden de elementos que se des- prenden del cuerpo humano (pelo, uñas, piel, etc.) o que han estado en contacto con la persona (cepillos de dien- tes, peines, semen, saliva, etc.).
• Cultivos celulares: Se utilizan en investigación casi exclusi- vamente, aunque cada vez se usan más con fines clínicos.
• Otras muestras: Desde el punto de vista clínico, es in- teresante estudiar el ADN de organismos no humanos como bacterias, virus, etc. La extracción y estudio del ADN de patógenos para su identificación es cada vez más común para identificarlos.

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4.2 Fundamento de las técnicas de extracción

El principal objetivo de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos es separarlos de otros componentes celulares sin que se vea afectada su integridad. Para conseguir esto, lo más habitual es realizar la extracción mediante tres procesos seriados, que pueden variar dependiendo de las técnicas em- pleadas. Estos procesos son la lisis de las estructuras tisu- lares o celulares (lisis celular), inactivación de nucleasas y purificación de los ácidos nucleicos. En este punto describiremos qué sucede en cada uno de estos procesos, para poder comprender qué sucede en las diferen- tes técnicas de extracción que aprenderemos en esta unidad.

4.2.1. Lisis celular

Los ácidos nucleicos se encuentran en el interior de las células, ya sea en su citoplasma o en el interior del núcleo, protegidos de los agentes externos. Para poder extraerlos el primer paso es romper las membranas y las estructuras en las que estan contenidos, lo cual liberará los ácidos nucleicos la disolución. Existen diferentes maneras de romper las membranas sin afectar a los ácidos nucleicos, pero los más destacados son:

Métodos físicos de lisis

Son los más sencillos y tienen la ventaja de que no es necesa- rio trabajar con reactivos que podrían alterar la muestra. En- tre ellos, los más comunes son la homogenización mecánica, la sonicación (lisis mediante sonidos) o los cambios bruscos de temperatura (shock térmico).

Métodos químicos de lisis

Son los más usados y consisten en su gran mayoría en el uso de detergentes, como el dodecil sulfato sódico (SDS), para desestabilizar las membranas lipidicas de las células y pre- cipitar las proteínas.

Métodos enzimáticos de lisis

Consisten en utilizar lipasas y proteinasas que rompen las membranas lipídicas y las proteínas asociadas a los ácidos nu- cleicos (como las histonas). La mas frecuente es la proteinasa K. 1440 145

Imagen 2. El shock térmico por bajas temperaturas es una alternativa ba- rata para producir la lisis celular « 6Biología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

4.2.2. Inactivación de nucleasas

Una vez que los ácidos nucleicos están libres en la disolución que estamos preparando, debemos evitar que se degraden por la actividad de las enzimas que se han liberado durante la lisis celular. Las enzimas que más pueden interferir con las futuras valoraciones que hagamos son las nucleasas, cuya ac- tividad consiste especificamente en la ruptura de las cadenas de ácidos nucleicos. Para conseguir inactivar las nucleasas, lo habitual es utilizar EDTA, que "secuestra" los iones de magnesio que necesitan para activarse. El EDTA es un reactivo compatible con los de- tergentes usados para la lisis celular, por lo que lo habitual es unir estos dos pasos en solo uno, lo cual además evita la de- gradación de los ácidos nucleicos. Para algunas valoraciones, en las que solo nos interesa en ADN, pueden añadirse ARNasas (tipo de nucleasas) posterior- mente, que degradarán el ARN dejando el ADN intacto.

HO O OH N N HO O OH O Imagen 3. Fórmula química del EDTA

4.2.3. Purificación de ácidos nucleicos

Llegados a este punto, hemos obtenido una mezcla de dife- rentes elementos en la que los ácidos nucleicos están libres y estables. Sin embargo, esta mezcla aún no es apta para aná- lisis, pues debemos eliminar los componentes que pueden interferir con las futuras valoraciones que realicemos. Este proceso de separación es lo que conocemos como purifica- ción de ácidos nucleicos. Para purificar los ácidos nucleicos, lo más habitual es utilizar etanol, que hace que los ácidos nucleicos precipiten, permi- tiéndonos separarlos fácilmente de los restos celulares que hay en la muestra. Debemos tener en cuenta que el pH de la disolución debe ron- dar valores de 5-6 para ARN y de 8 para la extracción de ADN. Las muestras de ácidos nucleicos obtenidas deben conservar- se en refrigeración hasta los análisis, llegado a tener una vida útil de hasta 3 años si se conservan adecuadamente.

Imagen 4. Precipitado de ADN (sustancia blanca) « 7Biología molecular y citogenética | UNIDAD 4 Técnicas de extracción de ácidos nucleicos

4.2 Técnicas manuales de extracción de ADN

Ahora que ya conocemos de manera general qué sucede a nivel molecular cuando extraemos el ADN, es el momento de conocer técnicas específicas que aplicaremos en nuestro puesto de trabajo. Comenzaremos conociendo las técnicas manuales para más tarde explicar como funcionan los siste- mas automáticos de extracción de ADN. Las técnicas manuales más empleadas son dos principalmen- te, una basada en el uso de una mezcla de disolventes orgáni- cos, y la técnica de extracción salina:

Extracción de ADN mediante mezcla de disolventes orgánicos

Esta técnica utiliza una mezcla de fenol-cloroformo para pro- ducir la lisis celular, tras lo cual se precipita el ADN con isopro- panol y se separa. A continuación, se detalla un protocolo a seguir como ejemplo:

1. Precipitación de las proteínas:

• Añadir 600 ML de una mezcla de fenol-clorofor- mo-alcohol isoamílico (25:24:1).
• Agitar y centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm, tras lo cual se recupera la fase superior en un microtubo estéril.
• Repetir.

2. Eliminación de fenol:

• Añadir 600 uL de cloroformo, agitar y centrifugar 5 mi- nutos a 14.000 rpm.
• Recuperar la fase superior en un Eppendorf estéril.
• Repetir.

3. Para la precipitación de los ácidos nucleicos:

• Añadir 1 mL de isopropanol.
• Mezclar suavemente e incubar al menos 1 h a -20 ℃.

4. Lavado del precipitado:

• Centrifugar 20 minutos a 14.000 rpm.
• Eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
• Lavar con etanol 70% helado y centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.
• Extraer todo el alcohol remanente.
• Resuspender el depósito del fondo (pellet) en agua estéril.

Isoamílico-Cloroformo Fenao-Cloroformo PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS D ADN Proteínas, restos de membrabas, lípidos SEPARACIÓN PRECIPITACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y CENTRIFUGACIÓN LAVADO CON ALCOHOLES DE MENOR GRADO + DILUCIÓN CON AGUA O BUFFER

Imagen 2. Resumen del método de extracción de ADN por mez- cla de disolventes orgánicos « 8