Variación somaclonal y selección in vitro en tejidos vegetales

Variación Somaclonal y Selección In Vitro

En este tema vamos a hablar de una aplicación del cultivo in vitro no para conservar el genoma sino para cambiarlo basándonos en un fenómeno llamado variación somaclonal.

Definición de Variación Somaclonal

En este esquema tenemos una parte de la PGRs, light/dark, temperature, nutrients DNA damage and repair planta que sacamos al medio donde modificamos todo su ambiente con el Cell fate Organogenesis Somatic embryogenesis (Cell division) ....... switch objetivo de inducir una desdiferenciación deddiferentiation diferentiation y una posterior diferenciación por LHP1, PLT, STM, WUS, KNOX, NAM, ATAF1, CUC2, MAPK12, GSTU10, BXL1 ... BLI, GEM, GL2, DCL1 ... organogenesis o embriogénesis para tener clones. Además de los genes ya vistos, para Pc-G (CLF, SWN ... ), Trx-G (PKL, PKR2 ... ), PCNA, RNR2, KYP, SWI2/SNF2(BRM, SYD), MET1, DRM2, CMT3 ... que esto sea posible, debe producirse la división celular en la que funcionan sistemas de reparación del daño genético para evitar mutaciones causadas por los errores espontáneos o inducidos por las condiciones ambientales en la replicación.

En un proceso como el que ocurre en cultivo in vitro donde las divisiones celulares son muy rápidas, el sistema de reparación debe funcionar correctamente para que las plantas obtenidas sean clones idénticos a la planta donadora (plantas idénticas entre sí e idénticas a la planta de partida porque se parte del mismo DNA). De forma ideal de cada célula que se está dividiendo obtenemos una planta completa, pero si hay mutaciones que no se detectan o no se reparan, plantas obtenidas estarán mutadas y puede que no sean iguales a la de partida a nivel genotípico o fenotípico.

Esto es el ambiente del cultivo in vitro donde tenemos unos explantes en un medio al que le añadimos hormonas e inducimos una serie de estreses de forma que:

• Se desregula la expresión génica de una serie de genes provocando la diferenciación, la proliferación y la regeneración.
• Se dan cambios a nivel epigenetico implicados en el desarrollo para la obtención de plantas por las respuestas ya vistas.

➢ Se producen cambios genéticos: a nivel de cromosoma, cambios en la secuencia o cambios por movilización de elementos transponibles.

La consecuencia es la obtención de plantas que pueden no ser iguales, y a las diferencias entre ellas es lo que se llama variación somaclonal. La variación somaclonal se define como la variación que aparece en las plantas obtenidas por cultivo in vitro.

Regeneración in vitro Explant and culture systems Hormones · Auxins Stresses . Protoplast . Nutrients and other chemicals . Cell suspension . Cytokinins · ABA · Wounding . Callus . Enzyme action · Root cultures · Disturbed circadian rhythm . Shoot tip and meristem . Ethylene . Physical factors · Embryo . Microspore . Redox environment · Photo periods Gene expression regulation Genetic changes Epigenetic changes · Protein Kinases: SERK, HK . Chromosomal level changes MET1,DRM2 · TF genes: WIND1, WUS . DNA sequence changes . Chromatin remodeling: · Structural genes: . Transposition and PICKLE, KYP Actin, Globulin Molecular changes amplification · Small RNA mediated regulation Developmental program · Dedifferentiation · Proliferation *Somatic embryogenesis * Organogenesis Acquisition of cell fates · Somacional variation leelakandan K. Wang (2012) Recent progress in the understanding of tissue culture-induced genome level changes in plants and potential applications.Pl 1 In vitro environment . Gibberellins · DNA methylation:La variación gametoclonal es lo mismo, pero se refiere a plantas que obtenemos cuando cultivamos los gametofitos.

Tipos de Variación

La variación genotípica se produce por cambios genéticos que son heredables de generación en generación o de cambios epigenéticos que no se heredan al completo porque durante la meiosis y las primeras etapas del desarrollo embrionario se borran la mayoría de las marcas epigenéticas (a veces se heredan como epialelos). Ambos pueden conducir a variaciones fenotípicas que son aquellas que se ven y se pueden medir: caracteres morfológicos, bioquímicos, metabólicos ...

Cuando hablamos de cambios genéticos, estos se pueden dar:

• En el núcleo:
  • Cambios citogenéticos: a nivel de contenido de DNA y del número y/o estructuras de los cromosomas.
  • Cambios en la secuencia de DNA.
  • Cambios epigenéticos: movilización de elementos transponibles.
• En el citoplasma: concretamente en las mitocondrias o en los cloroplastos.

Análisis de la Variación Somaclonal

Análisis de la Variación Fenotípica

Los cambios fenotípicos pueden afectar a caracteres cualitativos que están controlados por genes con efecto mayor, es decir, el típico mendeliano en donde intervienen uno o dos genes con dominancia completa o no. Para el análisis se hacen cruzamientos y análisis de la descendencia y se comprueba si las variaciones son heredables y si la segregación es mendeliana.

En la imagen se pueden observar cambios de este tipo en diferentes especies.

Observación de los fenotipos Caracteres cualitativos LNL WT Khayat et al. Musa. (Long and Narrow. Leaf) ell division)? anogenesis Somatic embrvozenesis

Los cambios fenotípicos también pueden afectar a caracteres cuantitativos como la altura, la floración, que en mejora son los más importantes. Aquí tenemos, por ejemplo, plantas regeneradas de arroz con diferente altura y fotografías donde hay floración temprana y tardía que es muy importante en la agricultura para poder cubrir las épocas del año sobre todo si la especie con la que se está trabajando genera un fruto que es lo que se comercializa. Esto también se puede conseguir con invernaderos.

Caracteres cuantitativos variación continua Bằng Cell fate Switch (Cell division)>

Análisis de la Variación Genotípica

Para analizar la variación genotípica se recurren a:

• Técnicas citogenéticas:
  • Evaluación de cantidad de DNA.
  • Evaluación de la estructura y el número de los cromosomas.
• Técnicas moleculares (marcadores moleculares) basadas principalmente en la PCR:
  • Evaluación de secuencias específicas.
  • Evaluación de secuencias aleatorias.

Técnicas Citogenéticas

Vamos a ver el ejemplo de una planta ornamental llamada Tricyrtis hirta donde la planta A es el control y la B, C y D son plantas regeneradas y se pueden observar las plantas completas, sus hojas y sus flores.

Por citometría de flujo miden el contenido de DNA y ven que:

• La B tiene el pico en el mismo sitio que el control y el tamaño de la hoja es casi igual al control.
• La C tiene el pico en el mismo sitio que el control, pero la hoja no está en tan buenas condiciones como la del control.
• La D tiene el pico más a la derecha, es poliploide y por ello su hoja es bastante más grande que la del control.
• En el callo la mayoría de las células conservan el número cromosómico original, diploide, pero hay algunas que son poliploides. Esto supone que la planta D se ha regenerado de estas últimas células y la planta entera ha salido poliploide.

Hay que fijarse que no se ha analizado el número cromosómico, pero con la cantidad de DNA se puede saber que la D es poliploide.

Citológicas Contenido de DNA (4) callo Control (A) (A) (B) (C) (D) Tricyrtis hirta Reg. (B) 150 Reg. (C) (A) (B) (C) (D) 200 150 Reg. (D) * ** 200 Orga (A) (B) (C) (D) Citometría de flujo Somi

Marcadores Moleculares

Normalmente nos referimos a marcadores de DNA. La ventaja de usarlos es que se pueden usar en cualquier momento de la vida del individuo porque el DNA de las células no cambia. Entonces cuando tenemos plantas regeneradas todavía saliendo del callo, se puede extraer su DNA para evaluar si presentar variación o no, mientras que para evaluar los caracteres fenotípicos suele ser necesario esperar a que las plantas lleguen a su madurez.

En muchos casos se utilizan técnicas basadas en la PCR y/o secuenciación y se pueden evaluar:

3 Contenido de DNA· Secuencias específicas: microsatélites, RFLP. · Secuencias anónimas (aleatorias): tienen la ventaja de que son multilocus y se generan muchos marcadores. Existen varias técnicas: RAPD, AFLP, IRAP y REMAP, ISSR.

Aunque normalmente se usan marcadores de DNA también pueden usarse marcadores bioquímicos como las isoenzimas. Estos marcadores tienen una herencia codominante y la técnica es rápida, pero el número de marcadores disponible es muy limitado. Por su parte, empleando PCR y secuenciación, el número de marcadores de DNA es muy alto.

Partimos de la hipótesis siempre de que las plantas regeneradas de un cultivo son genéticamente idénticas entre sí y respecto a la planta donadora, ya que suponemos que el cultivo nos sirve para una propagación clonal sin cambios. Usamos los marcadores moleculares para comprobar si esta hipótesis es cierta o no, de forma que, si encontramos modificaciones en los patrones de bandas, sabemos que las plantas no son genéticamente idénticas y la hipótesis no es cierta.

Técnicas

Técnica de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)

Existe una solo técnica basada en DNA que no se hace usando PCR y que es la técnica de Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) que consiste en un análisis de restricción combinada con hibridación de sondas. Se extrae el DNA de la planta y se hace digestión con endonucleasas de restricción de manera que se fragmenta todo el DNA que se separa en un gen. Este DNA se transfiere a una membrana mediante el Southern Blotting y después se hibrida con una sonda especifica (de un gen nuclear, de un gen mt ... ). Donde haya complementariedad de bases entre la zona y la membrana habrá hibridación con un patrón determinado que visualizamos usando marcaje radiactivo en una película de rayos X o marcaje no radiactivo con reacción de fluorescencia o de inmunohistoquímica. Da mucha información, pero dado que es muy laboriosa, no se suele usar.

DNA extraction Restriction endonuclease (2) (1) Plant Total DNA DNA fragments (3) Electrophoresis Hybridization solution Radioactive DNA probe (A) (B) Hybridization Southern blotting (4) (5) Probe binding to specific DNA DNA transferred to membrane Separated DNA on agarose gel Washing (6) (A) (B) Exposure to X-ray film develop and fixing (8) - (7) Membrane DNA with covalently bound probe X-ray film sandwiched to probe-bound membrane Band patterns on X-ray film (Autoradiograms)

Técnica Estándar

La técnica estándar se basa en PCR ligada a secuenciación. Dado que hemos visto muchas veces en que consiste la PCR, no vamos a profundizar en ello. Lo que vamos a estudiar son las modificaciones que hacemos cuando la PCR la queremos para obtener marcadores moleculares. En este caso buscamos es generar muchos fragmentos, cada uno de ellos es un marcador que diferencia a una planta de otra (por eso se llaman así).