Metodos de clonacion y secuenciacion del ADN, Universidad

Unidad 7

Métodos de clonación y secuenciación del ADN

Biología molecular y citogenética

Índice

Biología molecular y citogenética | UNIDAD 7

Métodos de clonación y secuenciación del ADN

• 7.1. Clonación del ADN
• 7.1.1 Tipos de clonación y fases del procedimiento de clonación
• 7.2. Secuenciación de ADN
• 7.2.1. Método de secuenciación de Maxam y Gilbert
• 7.2.2. Método de secuenciación de Sanger y Coulson
• 7.2.3. Secuenciación automática de primera generación
• 7.3. Secuenciación de nueva generación o secuenciación masiva (NGS)
• 7.3.1. Sistemas de amplificación del ADN para secuenciación
• 7.3.2. Reacciones de secuenciación
• 7.4. Secuenciación de 3ª generación
• 7.5. Secuenciación de ARN
• 7.6. Bioinformática: análisis de bases de datos de ADN
• 7.6.1. Bases de datos

Introducción a la Biología Molecular y Citogenética

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Métodos de clonación y secuenciación del ADN

En esta última unidad aprenderemos en qué consisten dos tareas básicas de mu- chos laboratorios, que son la clonación y la secuenciación del ADN.

Comenzaremos la unidad aprendiendo el concepto de clonación y las fases en las que se divide, aprendiendo de mane- ra general cómo funciona esta técnica.

Tras esto, dedicaremos la mayor parte de la unidad a la secuenciación del ADN, que juega un papel básico en la genética hoy en día. Para ello dedicaremos cuatro puntos de contenido en los que haremos un recorrido por las técnicas y cómo han evolucionado desde su origen.

Concluiremos este bloque con un corto punto en el que aclararemos las princi- pales particularidades de la secuencia- ción de ARN.

Para concluir la unidad, explicaremos cómo deben manejarse los datos de se- cuenciación de ADN mediante sistemas de información, en un punto dedicado a la bioinformática en el que prestaremos especial atención a las bases de datos.

Objetivos de la Unidad

Al finalizar esta unidad + Sabremos en qué consiste la clona- ción de ADN y conoceremos las eta- pas del proceso. + Sabremos en qué consiste la secuen- ciación de los ácidos nucleicos. + Conoceremos los fundamentos de va- rias técnicas de secuenciación de ADN. + Seremos conscientes de la evolución de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos desde su origen y sus perspectivas de futuro. + Conoceremos la relación entre la bioinformática y la secuenciación de ácidos nucleicos. + Conoceremos algunas de las prin- cipales bases de datos usadas para manejar la información obtenida de la secuenciación de ácidos nucleicos.

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Clonación del ADN

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Métodos de clonación y secuenciación del ADN

J 7.1. Clonación del ADN

En el contexto de la genetica, un clon es un ser vivo o una molécula de ácidos nucleicos que es identica a otra en su secuencia de nucleótidos. Es decir, que siempre que dos seres vivos tengan el mismo ADN los consideraremos clones, de manera que cualquier otro cambio que presenten entre sí, no es fruto directamente de su genética.

Sin embargo, puesto que esta titulación se centra en el labora- torio, deberemos prestar más atención a la parte molecular de la clonación, que es un proceso que realizamos constan- temente para poder trabajar con ácidos nucleicos. Sobre este tema ya hemos adquirido algunas nociones, pues al fin y al cabo cuando amplificamos el ADN mediante PCR, en esencia estábamos clonándolo.

Cuando hablamos de clonación en el contexto molecular usamos otra estrategia diferente a la PCR, que consiste en usar bacterias y colocar un fragmento de ADN en una molécula de ADN extracromosomica (generalmente plasmidos) con capacidad de autorreplicarse. Esto nos permite obtener fragmentos de ácidos nucleicos mucho más grandes que por PCR y que este se conserve adecuadamente gracias a la maquinaria con la que cuentan las bacterias.

Para aplicar esta técnica se necesitan tres elementos básicos:

• Vectores de clonación: son moléculas de ADN de pequeño tamaño con capacidad de autorreplicarse, como plásmidos.
• ADN exógeno: es el ADN que deseamos clonar y que debe tener un tamaño compatible con el vector que vayamos a utilizar.
• Célula huésped: ser vivo (normalmente una bacteria) que presenta características que hacen que sea relativamente sencillo introducir ADN exógeno sin que sea eliminado.

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Tipos de Clonación y Fases del Procedimiento

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Métodos de clonación y secuenciación del ADN

J 7.1.1 Tipos de clonación y fases del procedimiento de clonación

El proceso de clonación puede resultar complejo, pues es la suma de varios procesos moleculares que incluyen la síntesis del ADN que nos interesa, su inserción en vectores y su introduc- ción las células huésped. De manera más concreta, las fases de las que está compuesto este proceso son las siguientes:

Generación de fragmentos de ADN

Esta fase parte del supuesto de que ya tenemos aislado el ADN que nos interesa y cuya secuencia conocemos.

Tradicionalmente, para generar fragmentos se utilizan enzimas de restricción, que tienen la capacidad de realizar cortes en puntos concretos del ADN marcados por secuencias conoci- das (secuencias de corte). A la hora de generar los fragmentos, debemos tener muy en cuenta que las partes que nos intere- san no contengan en sus puntos intermedios secuencias de corte, pues haría que fuese muy poco probable que el siguien- te paso suceda adecuadamente.

Algunas de las enzimas de restricción más comunes se muestran en la siguiente tabla:

Enzima	Organismo de origen	Secuencia de corte
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	G.GATCC
EcoRI	Escherichia coli RY 13	G.AATTC
Hae III	Haemophilus aegyptius	GGCC
Hind III	Haemophilus influenzae Rd	A.AGCTT
Hpa I	Haemophilus parainfluenzae	GTT.AAC
Pst I	Providencia stuartií	CTGCA-G
Sma I	Serrada marcescens	CCCGGG
Sal I	Streptomyces albus C	G.TCGAC

Desde hace unos años, cada vez es más común el uso de un sistema revolucionario para realizar cortes en el ADN de manera dirigida, conocido como CRISPR/Cas9. A diferencia de las enzimas de restricción en las que es necesario buscar una enzima con capacidad de realizar cortes en secuencias específicas, este sistema permite seleccionar de antemano donde se producirá el corte de la cadena de ADN de manera exacta. Esto se debe a que este sistema utiliza fragmentos cortos de ARN que indican dónde debe producirse el corte

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Mecanismo del sistema CRISPR/Cas9

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J Básicamente, CRISPR/CAS9 consta de dos componentes:

• Un ARN guía, que tiene una secuencia complementa- ria a la zona donde deseamos efectuar el corte de la cadena de ADN.
• Una enzima (Cas9) con capacidad de cortar el ADN, que reconoce el ARN guía y se une a él para realizar los cortes de manera bastante precisa.

Este sistema ha supuesto una revolución en el trabajo con ADN, ya que permite realizar cortes de manera dirigida y sencilla a bajo coste. Esto ha supuesto una simplificación y un abarata- miento notable de los métodos que requieren cortar el ADN.

Zona de corte Cas9 - ARN guía 3' 5 Selección del lugar de corte (secuencia) 5 3 Zona de unión de Cas9 + Cas9 + Preparación de ARN guía y adición de Cas9 Corte Corte de cadenas de ADN Inserción en las células huéspedes

Imagen 1. Mecanismo del sistema CRISPR/Cas9 simplificado

Recombinación de fragmentos de ADN en vectores

La mayoría de las células cuentan con mecanismos para elimi- nar el ADN ajeno que pueda penetrar en su interior, por lo que para introducir las secuencias que nos interesan es necesario utilizar mecanismos que llamamos vectores.

Los vectores son moléculas de ADN de naturaleza variable (plasmidos, ADN vírico, etc.) a través de los cuales introduci- mos ADN exogeno en un organismo. Debido a la complejidad de los vectores de clonación, no nos adentraremos a distin- guirlos, pero debemos tener muy clara cuál es su función.

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Proceso de Recombinación y Transformación

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Métodos de clonación y secuenciación del ADN

J La incorporación del ADN exógeno se realiza mediante un proceso llamado recombinación. La recombinación es el fenómeno por el cual fragmentos diferentes de ADN se unen por los extremos cortados mediante enzimas de restricción (u otros métodos) para dar lugar a una molécula única. Esta molécula puede ser aceptada por el huésped sin ser eliminada, al mismo tiempo que incorpora el fragmento que nos interesa.

Aunque en teoría este proceso parece sencillo, lo cierto es que cada vez que "cortamos" un vector, existen muchas posibilidades de que el ADN exógeno no se incorpore de manera adecuada.

ADN exógeno ADN humano Plásmido recombinante Bacteria transformada Plásmido Corte con enzimas

Imagen 2. Recombinación de un vector (plásmido) y transformación de una bacteria

Transformación del huésped

Una vez que ya hemos generado un vector recombinante que contiene el ADN exógeno que nos interesa, debemos intro- ducirlo en una célula para poder clonarlo. Este proceso se conoce como transformación y puede ser muy diferente dependiendo del vector que estemos utilizando.

Para los plásmidos, debemos romper la barrera que supone la pared bacteriana y la membrana plasmática, para lo cual puede recurrirse a shocks térmicos, electroporación u otros métodos.

Si utilizamos virus, deberemos recrear condiciones óptimas para que infecten a las células diana e introduzcan el ADN en ellas.

Selección de clones

Una vez que hemos aplicado todos los pasos anteriores, obtendremos celulas que han incorporado el ADN exógeno y otras que no lo han hecho en un mismo medio. Será necesa- rio seleccionar las que nos interesan, para lo cual podemos recurrir a varios mecanismos de selección.

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Métodos de Selección de Clones

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Métodos de clonación y secuenciación del ADN

J Una manera habitual de seleccionar microorganismos es incluir genes de resistencia a antibióticos en los fragmentos de ADN exógeno. De esta manera, podemos añadir antibióticos al medio de cultivo en el que se encuentran los organismos transforma- dos, eliminando todos los que no nos interesan. Si realizamos cultivos en placa, obtendremos colonias de microorganismos, cada una de las cuales estara formada por clones identicos.

Otra manera de seleccionar clones sin necesidad de usar antibióticos es usar medios diferenciales y añadir genes para producir sustancias que nos permitan distinguir unas colonias de otras mediante indicadores de color.

Gen de resistencia a antibiótico Plásmido Las células que no han incorporado el vector mueren Las células que incorporaron el vector Sobreviven y forman colonias MEDIO DE CULTIVO CON ANTIBIÓTICO

Imagen 3. Selección de clones por resistencia antibióticos

Imagen 4. Selección de clones mediante medios de cultivo diferenciales

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