Apuntes de Bioquímica: Método Científico y Técnicas de Laboratorio

BIOQUÍMICA

TEMA 1. INTRODUCCIÓN AL MÉTODO CIENTÍFICO

El método científico o hipotético deductivo es un procedimiento que parte de la observación de un problema y el establecimiento de hipótesis para que, a partir de experimentos, podamos llegar a conclusiones que nos ayuden a la hora de elaborar una teoría. Se caracteriza por la falsabilidad y reproducibilidad de sus premisas. La falsabilidad se refiere a que una teoría puede ser tomada como falsa si existen experimentos cuyos resultados no concuerden con aquellos que valieron para la determinación de dicha teoría. La reproducibilidad, en cambio, se refiere a que los experimentos que sirvieron para la validación de la teoría deben ser reproducibles, es decir, deben poder repetirse.

El método consta de varias fases:

• Determinar el problema.
• Elaborar hipótesis.
• Probar las hipótesis. Para ello, es necesario diseñar y llevar a cabo diversos experimentos con la ayuda de materiales y un método a seguir. A su vez, debemos analizar los resultados y datos de forma cuantitativa y cualitativa mediante la elaboración de tablas, gráficas, bases de datos y estadísticas. Con esto se puede llegar a una conclusión acorde a nuestros resultados.
• Publicar los resultados mediante revistas científicas, congresos internacionales, libros relacionados con la materia o mediante patentes. Todo esto dará lugar a una referencia científica.

Una referencia científica es un texto que contiene diversa información acerca de los resultados obtenidos a partir de la aplicación del método científico a un problema determinado. En ella se incluyen el título y el nombre de los autores, además de datos como hipótesis y objetivos, los materiales y métodos utilizados, los resultados, discusiones y una reseña bibliográfica. A su vez, para la elaboración de la referencia científica, se hace uso de la información contenida en revistas científicas, conferencias internacionales y libros de consulta.

Por último, es importante tener en cuenta la diferencia entre ciencia y pseudociencia. Esta última consiste en una afirmación que, a pesar de presentarse como un hecho científico, no está basada en un método científico fiable, a diferencia de la ciencia.

TEMA 2. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL LABORATORIO

Una parte del equipo es general para muchos tipos de laboratorios diferentes. Es el equipo para preparar disoluciones.

También hay equipo para la separación de moléculas y su previa extracción, así como equipo para identificación y cuantificación de moléculas.

Además, hay equipo multidisciplinar, que es usado en distintas áreas.

Lo que suele utilizarse en bioquímica y biología celular son técnicas microbiológicas (cultivos), técnicas de cultivo in vitro (por ejemplo, para células que se propagan de forma vegetativa), técnicas de radioisótopos (para el marcaje de moléculas, por ejemplo). Como todo este equipo ocupa mucho, se reúnen en servicios de investigación, que son edificios con muchos laboratorios, cada uno con un equipo distinto.

Algunos de los equipamientos son:

• Preparación de disoluciones (química): Productos que se han comprado comercialmente, vasos de precipitados, agua destilada ultrapura, agitador magnético para disolver productos, phmetro para medir el pH, en ocasiones aforados para preparar agua destilada muy pura (se llama Milli-Q). El Milli-Q se controla midiendo la conductividad.

Autoclave: se usa por ejemplo para microbiología y para preparación de disoluciones (porque los recipientes deben estar esterilizados). La alta presión y el calor húmedo se combinan para alcanzar temperaturas mayores a 100℃ y esterilizar lo que hayamos introducido. No sólo mata, también desnaturaliza las proteínas.

Para saber si un recipiente ha pasado por el autoclave, se pegan unas cintas termosensibles, que a altas temperaturas se vuelven de color oscuro.

Horno: se usa para vidrio. A 170℃ durante 2 horas, esteriliza.

Seguridad en el laboratorio

En un laboratorio se está constantemente expuesto a diversos factores:

• Reactivos químicos. Pueden ser: tóxicos al respirarlos (campana extractora), irritantes a corto plazo, corrosivos (ácidos y bases > campana extractora), carcinógenos, venenos (actúan sobre la cadena respiratoria) o pueden producir daños irreversibles (por contacto o ingestión).

Lo mejor es evitar el contacto directo. Además, hay que saber exactamente qué se está manipulando para reaccionar en consecuencia.

Todos los reactivos tienen una descripción general en la etiqueta (en inglés).

• Peligros biológicos. Como fluidos (sangre, virus), animales/ vegetales (alérgenos), microorganismos patógenos.
• Equipo en general. Por equipo de laboratorio, existe peligro eléctrico (alto voltaje) o peligro mecánico (equilibrado de centrífugas, homogeneizador > cuchillas). También pueden ser peligros comunes, como los peligros cotidianos (pipetas de vidrio que se parten, agujas de jeringas, otros objetos de vidrio, etc). Por último, el peligro en la gestión de residuos (disolventes, ácidos, a la hora de esterilizar el horno, etc.).

Para algunos peligros comunes se usan guantes de látex, gafas de protección. Tampoco está permitido el uso de teléfonos móviles, comida o bebida. El uso de lentillas también está prohibido, sobre todo con cultivos bacteriológicos.

TEMA 3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y CENTRIFUGACIÓN

Para el procesamiento de muestras, es necesario saber cómo conservarlas. Para su conservación, se pueden someter a frío (4℃), a congelación o ultracongelación(-20℃ y - 80°℃ respectivamente), o se pueden manipular con nitrógeno líquido (-196℃). También es necesaria la ruptura de las células que constituyen el tejido que vayamos a estudiar. Para esto, existen varios métodos (homogeneización mecánica, prensa francesa, ultrasonidos, etc). Con moléculas como el ADN (se degrada muy rápido) se usa nitrógeno líquido, que congela instantáneamente la muestra (-196℃ a 1 atm), y después se mete la muestra inmediatamente en un ultracongelador (-80℃).

La homogeneización mecánica, realizada con un homogeneizador, consiste en disgregar los tejidos y romper las células causando el menor daño posible a la membrana plasmática. También se puede realizar con un mortero.

La prensa francesa es instrumento de laboratorio en el que se hacen pasar las células a gran presión por un pequeño orificio hasta otro compartimento que se encuentra a baja presión. Por tanto, se utiliza para la ruptura de las células por el efecto de descompresión.

La sonicación consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad generándose ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscópicas, las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana (cavitación).

Por último, también puede llevarse a cabo una lisis alcalina. Esto es válido para células sin pared celular (células detejidos animales), pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Este proceso consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde hacia el interior de la célula, hinchándola y causando su rotura. La lisis química se usa por ejemplo para extraer ADN de E. coli.

A su vez, es necesario controlar el medio de extracción de las biomoléculas a estudiar, que deberá poseer un pH cercano al neutro (7-8), antioxidantes (B-mercaptoetanol), sales, EDTA, detergentes (tritón X-100, SDS o dodecilsulfato sódico).

• Los antioxidantes evitan la oxidación de los componentes, debido a que se se oxidan estos compuestos y no las moléculas.
• EDTA. Es un quelante de iones metálicos para que no alteren nuestra molécula.
• Tritón X-100: es una molécula compleja que posee una parte hidrofóbica y otra hidrofílica, con lo que puede solubilizar las membranas, por ejemplo. Es un detergente no iónico con lo que es más suave que el SDS.
• SDS: También tiene una parte hidrofóbica y otra hidrofílica. Es un detergente iónico. Se usa para desnaturalizar proteínas hidrosolubles, porque su larga cadena hidrofóbica interacciona con los residuos hidrofóbicos internos.

Los detergentes no rompen enlaces sino que modifican enlaces no covalentes.

El punto isoeléctrico es el valor de pH en el que la mayor parte de las moléculas poseen carga neta global cero. Cuando esto ocurre, en el caso de los aminoácidos, se dice que están en forma de ión zwitterion. Por tanto, podemos definirlo como una partícula que no está cargada eléctricamente (su carga neta global es nula) a diferencia de los átomos que la constituyen.

El pK, sin embargo, es el valor de pH en el que encontramos iguales concentraciones de una especie y dela misma ionizada. Este concepto se refiere principalmente a los grupos funcionales. En el caso del grupo carboxilo, ronda un pH de 2.2-2.3; mientras que, en el caso del grupo amino, ronda un pH de 8-9.

El punto isoeléctrico de un péptido puede calcularse realizando la media de los dos valores de pK entre los cuales dicho péptido posee una carga neta global nula.

A medida que aumenta el pH, la concentración de grupos protonados disminuye y aumenta la concentración de iones zwitterión. Esta última empieza a decrecer a la vez que aumenta la concentración de grupos desprotonados hasta alcanzar el máximo pH.

La ecuación de Henderson-Hasselbalch relaciona el pH con el pK.

PH = pK + log [R-COO-]/[R-COOH]

Si el pH es alto, la proteína se desprotona y la carga global neta es negativa. La proteína es muy soluble.

Si el pH es bajo, la proteína se protona y la carga global neta es negativa. La proteína también es muy soluble. La proteína alcanza su mínimo de solubilidad cuando se encuentra en el punto isoeléctrico porque los átomos presentan tanto cargas negativas como positivas, lo que hace que se formen agregados entre las mismas proteínas y precipiten. Esto puede ser explicado debido a que, cuando las proteínas forman agregados, existe un menor número de moléculas de agua ordenadas, por lo que aumenta la entropía y resulta más favorable desde un punto de vista energético.

Los grupos de aspartato y los de glutamato tienen un pK de 3,9 y 4,1 respectivamente, de modo que las proteínas con muchos restos de Asp y Glu estarán en forma desprotonada y con carga negativa a PH neutro.

Por ejemplo, si tenemos una mezcla de diferentes proteínas y queremos aislar una en concreto, modificamos el pH de la disolución hasta que coincide con el pI de esa proteína, con lo que precipita. Después centrifugamos y así, separamos el sobrenadante.

Fuerza iónica

La fuerza iónica de una solución es una medida de la población total de iones que existen en ella, de lasfuerzas interiónicas de atracción y repulsión que se producen y, por consiguiente,una medida general de la falta de idealidad del entorno de la solución.

H = ECZ2

Ci = concentración molar de los iones Zi = carga de cada ión

Por ejemplo, en una disolución de NaCl 0,2 M.

μ = 글 ([C] · (-1)2) + 글 ([Na+] · (1)2)

H = ≥ (0,2 + 0,2) = 0,2

Debido a variaciones en la fuerza iónica del medio, podemos establecer distintos fenómenos:

• Salting in: aumento de la solubilidad de las proteínas con la fuerza iónica.
• Salting out: disminución de la solubilidad de las proteínas con la fuerza iónica. La sal añadida se disocia en sus iones y estos se solvatan con las moléculas de agua. Por tanto, la proteína no tiene agua y deja de ser soluble.