Unidad Didáctica 4: Pruebas de Identificación Microbiana de Cesur

Objetivos de la Identificación Microbiana

• Entender la importancia de la identificación de m.o en el laboratorio de diagnóstico microbiológico.
• Describir los medios, temperaturas y tiempos de incubación de los principales tipos de pruebas bioquímicas de identificación bacteriana.
• Realizar las pruebas bioquímicas individuales más significativas en la identificación bacteriana presuntiva.
• Explicar el mecanismo y utilizar sistemas multiprueba para la confirmación de aislamientos.
• Conocer las técnicas moleculares de identificación bacteriana.
• Identificar las técnicas proteómicas de identificación bacteriana.
• Interpretar los resultados de las pruebas de identificación bacteriana.

Recursos Web para Identificación Bacteriana

Enlaces Web de Interés

Sitio web del Bergey's Manual Trust, sección de descripciones taxonómicas: http://www.bergeys.org/index.html

Procedimientos en microbiología clínica de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Documento 37: Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc- procedimientomicrobiologia37.pdf

Vídeo del mecanismo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU

Vídeo descriptivo del procedimiento para realizar una tinción de Gram: http://www.bio-rad.com/webroot/web/html/lse/support/tutorial-gram-staining-wndw.html

Artículo «MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4525378

Base de datos GenBank para análisis de secuencias de ADN: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Manual de uso de la base de datos GenBank para análisis de secuencias de ADN: https://bioinf.comav.upv.es/courses/intro_bioinf/practica_blast.html

Base de datos para formateo de secuencias nucleotídicas: http://www.attotron.com/cybertory/analysis/seqMassager.htm

Vídeo sobre el uso de la galería Api 20E (inglés): https://www.youtube.com/watch?v=PXlis18qN9k

Vídeo de lectura de la galería Api 20E (inglés): https://www.youtube.com/watch?v=ew3amo02_b0

Artículo sobre la identificación bacteriana utilizando la secuenciación del ARNr 16S: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-iden- tificacion-bacteriana-mediante-secuenciacion-del-13059055

Enlaces web de interés para la complementación de información sobre identificación bacteriana

Introducción a la Identificación Microbiana

Miguel Laborda Blanc, Microbiología clínica.CESUR La identificación microbiana consiste en la determinación de las principales características de un microorganismo. Una vez determinadas estas características, Se comparan con las de microorganismos de referencia caracterizados con anterioridad, con el fin de proceder a realizar la clasificación del microorganismo de estudio en un determinado taxón. El término taxón (Grupo taxonómico o categoría taxonómica) Hace referencia a un grupo de seres vivos con características similares.

Existe una jerarquía de taxones en la que cada categoría engloba a otras menores subordinadas. Las categorías taxonómicas actuales son, De la más específica a la más general: especie, género, familia, orden, clase, filo y reino.

Cuanto menor (más específica) sea, la categoría taxonómica, Mayores serán las similitudes entre los organismos que pertenecen a esa categoría. La categoría menor, La más elemental de las citadas es la especie.

Jerarquía Taxonómica

Especie - Dominio - Reino Género - Phylum-Filo Familia - Clase Orden - Orden Clase - Familia - Genero Division · Especie Reino Dominio Vida

Clasificación Taxonómica de Salmonella enteritidis

Por ejemplo, la clasificación taxonómica de Salmonella enteritidis es:

• Especie: Salmonella enteritidis
• Género: Salmonella
• Familia: Enterobacteriaceae
• Orden: Enterobacteriales ▪ Clase: Gammaproteobacteria ▪ Filo: Proteobacteria ▪ Reino: Bacteria

Nomenclatura Microbiana

Una vez identificado y clasificado en un taxón, Se procede a asignar al microorganismo una nomenclatura, Utilizando reglas y normas establecidas por un sistema mundialmente aceptado. Así, El nombre asignado permitirá que el microorganismo sea reconocido en todo el mundo. Actualmente se utiliza el sistema binomial, En el que se emplean dos palabras escritas en letra cursiva o en su defecto, subrayadas.

• La primera palabra describe la categoría taxonómica de género y se escribe con su primera letra en mayúscula. Esta palabra puede estar relacionada con su descubridor, un científico relacionado o con la morfología.
• La segunda palabra indica la especie y se escribe todo en minúsculas. Esta palabra suele hacer referencia a alguna característica del organismo o a su patogenicidad en el caso de microorganismos.

Miguel Laborda Blanc, Microbiología clínica.CESUR Por ejemplo, Escherichia coli es una especie bacteriana que pertenece al género Escherichia. También pueden utilizarse formas abreviadas empleando la inicial del género en mayúsculas, seguida de un punto y el nombre de la especie, todo ello en cursiva (E. coli).

Los conceptos de identificación, clasificación y nomenclatura están muy relacionados, pero corresponden a disciplinas diferentes y no deben confundirse. No obstante, todas ellas están comprendidas en un mismo área de la ciencia denominada taxonomía. El creador de la taxonomía fue el botánico sueco Carl von Linneo en el siglo XVIII, y su sistema de nomenclatura, el sistema binomial es el que sigue empleándose en la actualidad.

Dominios de la Vida

Actualmente por encima del taxón de Reino, se han establecido 3 dominios en función del tipo de células que presentan los organismos:

• Bacteria (procariotas unicelulares cuya pared celular contiene peptidoglicano).
• Archaea (procariotas unicelulares cuya pared celular no contiene peptidoglicano).
• Eukarya (todos los eucariotas).

Esta unidad se centra en los métodos de identificación bacteriana, puesto que en las unidades didácticas 7, 8 y 9 se estudia con detenimiento otros m.o de interés, como los hongos, parásitos y virus.

En la actualidad, los sistemas de identificación bacteriana se centran en las características de diferentes especies bacterianas, recogidas en el Manual de Bergey "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Las primeras ediciones del manual se basaban en métodos de identificación fenotípicos, pero las últimas versiones han incluido los recientes métodos moleculares y proteomicos de identificación bacteriana.

Los métodos de identificación que se detallan en los siguientes apartados no son los únicos que existen, pero sí son los de mayor relevancia y utilidad en el laboratorio de microbiología. Se describen métodos fenotípicos o tradicionales, métodos moleculares y métodos proteómicos.

Métodos Fenotípicos de Identificación Bioquímica

La identificación bacteriana se puede llevar a cabo mediante métodos fenotípicos, los cuales se basan en la determinación de algunas características observables de las bacterias. Los métodos fenotípicos son mucho más sencillos y accesibles. No obstante, los resultados obtenidos no proporcionan una certeza absoluta, sino que indican el género y especie más probable al que puede pertenecer la bacteria estudiada. Los métodos moleculares o proteómicos se emplean cuando los métodos fenotípicos no logran la identificación bacteriana, u ofrecen un diagnóstico dudoso, por lo que están sustituyendo a los métodos fenotípicos.

En los métodos fenotípicos, la experiencia del microbiólogo juega un papel muy importante, ya que es clave a la hora de determinar la prueba o secuencia de pruebas a realizar. Estas decisiones se toman atendiendo al origen de la muestra, el tipo de infección, el género o la especie a identificar, la fiabilidad de las pruebas o el coste de las mismas. Habitualmente, los laboratorios de microbiología siguen procedimientos estandarizados de identificación. Estos procedimientos/protocolos recogen una serie de pruebas que permiten la identificación de la gran mayoría de bacterias que pueden estar implicadas

Miguel Laborda Blanc, Microbiología clínica.CESUR en un proceso infeccioso. No obstante, existen grupos bacterianos con características especiales cuya identificación requiere de protocolos específicos, como es el caso de bacterias anaerobias, micobacterias, ricketsias, clamidias, micoplasmas o espiroquetas.

Conceptos Clave en Identificación Fenotípica

Recuerda que ... La identificación fenotípica consiste en la rea- lización de diversas pruebas bioquímicas, cada una de las cuales nos permite determinar visual- mente algunas características específicas de las diferentes especies bacterianas.

El genotipo es la información recogida en los genes de un organismo, mientras que su feno- tipo es la manifestación/expresión de dicho ge- notipo en un determinado ambiente.

Niveles de Análisis en Identificación Bacteriana Fenotípica

En el proceso de identificación bacteriana fenotípica se establecen tres niveles principales de análisis. En función del grupo en el que se ubique la bacteria en cada prueba o nivel, se seleccionan unas pruebas u otras para continuar con la identificación.

En los dos primeros niveles, la hipótesis se apoya en las características del cultivo bacteriano y en pruebas primarias. Las pruebas primarias son: tinción de Gram, estudio de la morfología de las colonias, prueba de la catalasa, oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de la glucosa, producción de esporas, crecimiento en aero-/anaerobiosis y movilidad.

En el primer nivel de análisis se realizan pruebas primarias generales que permiten ubicar provisionalmente a la bacteria en una de las principales categorías bacterianas. Consisten en estudios macro-/microscópicos rápidos y sencillos de realizar.

De forma habitual, la primera prueba es la tinción de las bacterias para su observación microscópica. Otra prueba principal es comprobar que atmósfera necesitan las bacterias para crecer. Pruebas como la oxidasa, catalasa o crecimiento en medios selectivos permiten concretar más dentro de los grandes grupos microbianos en este nivel de análisis.

En el segundo nivel de análisis se realizan pruebas primarias más específicas que permiten dilucidar el género al que pertenece la bacteria estudiada. En este nivel de estudio se consideran los datos clínicos (tipo de muestra, síntomas y signos del paciente, etc.).

En el tercer nivel de análisis se realizan pruebas específicas, que permiten la identificación a nivel de especie de la mayoría de bacterias de importancia clínica.

Características Macroscópicas

➢ Características macroscópicas:

Miguel Laborda Blanc, Microbiología clínica.