Cromatografia e HPLC: principi e meccanismi di separazione delle miscele

CROMATOGRAFIA

La cromatografia è una tecnica analitica che comprende una serie di metodi finalizzati alla separazione di una miscela nei suoi componenti, al fine di consentirne il riconoscimento sia qualitativo che quantitativo. Alla base di queste tecniche c'è la diversa distribuzione dei componenti tra due fasi: una viene detta fase fissa o fase stazionaria, mentre l'altra è la fase mobile o eluente, che fluisce in modo continuo attraverso la fase fissa. Il termine "cromatografia" ha origine storica: le prime separazioni venivano effettuate su composti colorati e le sostanze, una volta separate, venivano identificate grazie al loro colore.

Distribuzione dei componenti tra fase fissa e fase mobile

Quando una specie chimica viene depositata sulla fase stazionaria e introdotta nella corrente della fase mobile, essa tende a distribuirsi tra le due fasi in modo dinamico. Tale distribuzione dipende dalla maggiore o minore affinità della sostanza per ciascuna fase. La fase mobile, che può essere un liquido o un gas, scorre ininterrottamente sopra la fase stazionaria, la quale può consistere in un solido o in un liquido immobilizzato. In questo modo, i soluti contenuti nella miscela vengono trascinati lungo il sistema, e la separazione avviene proprio in base alle loro diverse affinità per le due fasi. Se una delle due fasi, la stazionaria, viene mantenuta ferma, mentre l'altra, la mobile, viene fatta scorrere attraverso di essa, si riesce a realizzare un'estrazione continua. In ogni caso, va tenuto presente che le tecniche cromatografiche sono considerate distruttive, poiché richiedono che il campione sia sciolto in opportuni solventi. Infatti, per l'analisi, si preleva sempre una piccola quantità di campione, da uno a pochi microlitri, e lo si introduce nella fase mobile, che può essere anche un fluido supercritico. La fase mobile viene poi fatta scorrere all'interno della fase stazionaria, che si trova di solito in una colonna o, in alternativa, su una superficie piana. È fondamentale che le due fasi siano immiscibili, e che la separazione si basi sul principio secondo cui i diversi componenti della miscela si distribuiscono in modo differente tra le due fasi. Le sostanze che hanno maggiore affinità per la fase stazionaria rimangono più a lungo trattenute, spostandosi quindi più lentamente, mentre quelle con maggiore affinità per la fase mobile si muovono più velocemente attraverso il sistema.

Costante di ripartizione e terminologia di base

Il processo di separazione si fonda sulla costante di ripartizione, un valore caratteristico per ogni sostanza, che esprime il rapporto tra la sua concentrazione nelle due fasi.Alcuni termini fondamentali aiutano a comprendere meglio il funzionamento della cromatografia. La colonna cromatografica è un tubo, generalmente in vetro o plastica, riempito con un materiale solido attivo, detto adsorbente. La miscela da separare viene applicata nella parte iniziale della colonna, e un solvente viene fatto scorrere per effettuare l'eluizione. La separazione dei componenti si visualizza come una successione di zone lungo la colonna, formando quello che viene definito cromatogramma. Il sistema cromatografico, dunque, è costituito dalla miscela, dall'adsorbente e dal solvente che ne permette l'eluizione.

Interazioni tra le sostanze e le fasi cromatografiche

Le interazioni che avvengono tra i componenti della miscela e le due fasi devono essere sufficientemente deboli, altrimenti si rischierebbe che una sostanza venga trattenuta in modo permanente o, al contrario, che venga subito eluìta senza alcuna separazione. Per ottenere un'efficace separazione, si sfruttano interazioni come il legame a idrogeno, le interazioni dipolo-dipolo e dipolo-dipolo indotto, le forze di Van der Waals, la formazione di composti di interazione, la trazione coulombiana e le interazioni steriche. Tutte queste interazioni sono fortemente influenzate dalla polarità delle due fasi, e spesso nello stesso processo cromatografico possono coesistere più di un tipo di interazione.

I principali meccanismi di separazione

La separazione cromatografica sfrutta in modo molto efficiente la tendenza delle molecole a distribuirsi tra due fasi differenti, sulla base di legami chimici secondari. In base al tipo di interazione che si instaura tra le molecole e le fasi, si distinguono diversi meccanismi di separazione, ciascuno alla base di specifiche tecniche cromatografiche. I meccanismi fondamentali sono: adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, esclusione e affinità.

Meccanismo dell'adsorbimento

Nel meccanismo dell'adsorbimento, la fase stazionaria è costituita da un solido in polvere steso su un supporto. Sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi capaci di instaurare legami deboli ma reversibili con le molecole della miscela. Questo tipo di cromatografia, detta cromatografia di adsorbimento, può avvenire in due forme: gas-solido o liquido-solido, a seconda della natura della fase mobile. È particolarmente adatta per la separazione di sostanze neutre, polari o non polari, sia di natura organica che inorganica. Diversi fattori influenzano ilCROMATOGRAFIA fenomeno dell'adsorbimento: la struttura reticolare del solido, lo stato fisico dell'adsorbente, ovvero la sua superficie di reazione (che deve essere il più estesa possibile), la struttura molecolare dell'assorbito, e in particolare la sua polarità. Le molecole dotate di gruppi polari come -OH o -NH2 saranno più trattenute rispetto a molecole non polari. Anche la temperatura e la pressione influiscono: l'aumento della temperatura provoca una maggiore agitazione molecolare e quindi una rottura dei legami, mentre un aumento della pressione favorisce l'adsorbimento dei componenti gassosi sulla superficie solida. In sintesi, l'adsorbimento si basa sulla selettività del trattenimento da parte della fase stazionaria nei confronti di molecole diverse.

Meccanismo della ripartizione

Nel meccanismo della ripartizione, la fase stazionaria è costituita da un liquido che impregna un solido granulare inerte o ad esso chimicamente legato. Le molecole da separare devono essere solubili in questo liquido, mentre la fase mobile, anch'essa liquida o gassosa, deve essere immiscibile con la fase stazionaria. Durante il processo di eluizione, le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi in base alla loro diversa solubilità.Si parla in questo caso di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido, a seconda della fase mobile. Quando la fase stazionaria è più polare della fase mobile, si parla di fase normale, mentre si parla di fase inversa quando la fase stazionaria è meno polare. Quest'ultima è la più utilizzata nella separazione di sostanze organiche. I componenti della miscela si ripartiscono tra le due fasi secondo una costante di ripartizione, che rappresenta il rapporto tra le concentrazioni del soluto nei due solventi.

Meccanismo dello scambio ionico

La cromatografia a scambio ionico sfrutta una fase stazionaria costituita da un polimero inerte che contiene siti attivi ionizzati, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione si basa sulla competizione per i siti di scambio tra i controioni della fase mobile e quelli presenti nel campione. Esistono due tipi principali di resine scambiatrici: quelle cationiche, deboli o forti, che scambiano cationi e sono cariche negativamente, e quelle anioniche, anch'esse deboli o forti, che scambiano anioni e sono cariche positivamente.

Meccanismo dell'esclusione

Nel meccanismo dell'esclusione, la fase stazionaria è un gel con pori di dimensioni diverse. I componenti della miscela vengono separati in base alla dimensione molecolare: le molecole più piccole riescono a penetrare nei pori del gel e quindi impiegano più tempo per attraversare la colonna, mentre le molecole più grandi non riescono a entrare nei pori e percorrono un tragitto più diretto, eluendo più velocemente. Questa tecnica è particolarmente usata per separare molecole organiche ad alto peso molecolare e si distingue in gel permeazione (per sostanze insolubili in acqua) e gel filtrazione (per sostanze solubili in acqua).

Gel permeazione

La gel permeazione è un caso specifico della cromatografia di esclusione. In essa, una sostanza polimerica dispersa in un solvente può penetrare nei pori di un gel oppure no, a seconda delle sue dimensioni. Una molecola piccola ritarderà l'uscita dalla colonna perché entra nei pori e compie un percorso più lungo, mentre una molecola grande viaggia più velocemente perché non riesce a penetrare nel gel.

Meccanismo di affinità

La cromatografia di affinità sfrutta reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, per separare le molecole che possono interagire con la fase stazionaria. Su quest'ultima viene immobilizzato un ligando, ad esempio un anticorpo: caricando il campione nella colonna, solo le molecole capaci di legarsi al ligando verranno trattenute. In seguito, queste molecole possono essere eluite mediante l'utilizzo di una fase mobile opportuna. Questa tecnica è particolarmente adatta per la separazione di molecole di interesse biochimico, come proteine o enzimi.

Le tecniche cromatografiche: una panoramica generale

La cromatografia comprende diverse tecniche, distinte in base al meccanismo di separazione predominante e al modo in cui si presentano la fase stazionaria e quella mobile. Le applicazioni possono andare da strumenti semplicissimi - come un foglio di carta porosa immerso in un recipiente contenente solvente - fino a dispositivi avanzati, dotati di componenti computerizzate per l'acquisizione dei dati. Una prima classificazione si può fare in base alla forma del letto cromatografico, distinguendo tra cromatografia su colonna e cromatografia planare. Un'altra classificazione, invece, si basa sullo stato fisico della fase mobile, distinguendo così tra cromatografia liquida, gas-cromatografia e cromatografia con fluido supercritico.