Metodologie e modelli sperimentali animali per lo studio del dolore

Argomenti 11ª lezione

• Dolore
• metodi per lo studio dell'attività nocicettivaMetodologie e modelli utilizzati per lo studio di farmaci analgesici

fppt.com

Definizione di dolore

International Association
for the Study of Pain
(IASP)
"Spiacevole esperienza
sensitiva
o
emotiva
associata ad un danno
tissutale
potenziale
o
effettivo,
o
descritta
come tale"

Secondo questa definizione sono considerati dolore:
Es puntura di un ago
la nocicezione (causato da puntura di un ago) SE in un essere conscio e se
spiacevole
la sofferenza, una condizione di dolore, che può riguardare il corpo e/o il
vissuto emotivo del soggetto (provocato dalla puntura di un ago o dalla
possibilità di essere punti)
l'angoscia (paura perdurante di essere punti)
distress (danno psicofisico derivante e connesso ad un perdurante stato di
angoscia per il timore di essere punti da un ago)
In quest'ottica dolore è anche l'isolamento di specie sociali dai consimili,
la presenza di prede e predatori nello stesso ambiente ecc.

Basi anatomiche e fisiologiche del dolore

Negli animali e nell'uomo il dolore è
regolato dalle stesse basi anatomiche e
fisiologiche.
Il dolore si compone di:
Parte
percettiva
(nocicezione)
che
costituisce la modalità sensoriale che
permette la ricezione ed il trasporto al
sistema nervoso centrale di stimoli dannosi
per l'organismo
Parte esperienziale (esperienza del dolore
vera e propria) che costituisce lo stato
psichico collegato alla percezione di una
esperienza spiacevole

Percezione centrale del dolore

Percezione centrale
Corteccia
Talamo
Ritrasmissione
e modulazione discendente
Tronco
encefalico
1
Trasmissione
1
Midollo spinale
Conduzione
Stimolo periferico
Trasduzione del segnale

Percezione centrale
Corteccia
Talamo
Ritrasmissione
e modulazione discendente
Tronco
encefalico
1
Trasmissione
1
Midollo spinale
Conduzione
Stimolo periferico
Trasduzione del segnale
La sensazione dolorosa è mediata
da un sistema che si estende dalla
periferia con i nocicettori, fino alla
corteccia passando attraverso il
corno
posteriore
del
midollo
spinale.
Per limitare i danni il nostro
organismo
ha
imparato
ad
associare all'attivazione di questa
via sensazioni spiacevoli (sistema
di difesa)

Classificazione del dolore per durata

In base alla durata del fenomeno distinguiamo il dolore in:
Dolore acuto:
dolore ad inizio recente e durata limitata. Generalmente è
correlato ad un danno tissutale o ad una malattia (Ready
and Edwards, 1992)
Dolore cronico:
dolore
persistente
per lunghi
periodi
di
tempo.
Generalmente persiste al di là del tempo di guarigione del
danno e può non avere una causa identificabile (Ready and
Edwards, 1992)

Risposta al dolore negli animali

La maggior parte degli animali risponde al dolore acuto con
riflessi di evitamento accompagnati da vocalizzazioni e seguiti
da leccamento, grattamento, facies ecc.
Il dolore cronico è più difficile da riconoscere e causa
alterazioni del comportamento, del quadro clinico e dell'aspetto
dell'animale. Si ha riduzione dell'attività, mancanza di appetito
o di interazioni sociali.
La risposta al dolore dipende dalla specie, dall'età, dal sesso e
dalle precedenti esperienze.

Scale di codifica facciale del dolore

Scale di codifica facciale del dolore
Il dolore può essere codificato mediante
espressioni facciali che possono essere
utili per quantificare il dolore in pazienti
umani non verbalizzanti.
Recenti studi dimostrano che l'espressione
facciale del dolore può essere utilizzata
anche nei roditori.
Per quantificare il dolore nei topi e ratti
può essere utilizzata la Grimace Scale
basata su azioni facciali come la chiusura
degli occhi o la posizione del naso e delle
orecchie

Grimace Scale nei roditori

Not present
Moderate
Severe
2
0
1
Orbital tightening
Coding of facial expressions of
pain in the laboratory mouse
Dale J Langford et al., Nat Methods
. 2010 Jun;7(6):447-9.

Grimace Scale
Assente
Moderato
Severo

Metodi per lo studio dell'attività nocicettiva

• Meccanici (test del pinzettamento, Von Frey test,
  Randall Sellito test)
• Termici (hot plate test, tail flick test, tail
  immersion test)
• Chimici (formalin test, writhing test)

Metodi meccanici

Rat Tail
Rat Holder
Tail Clip
Pinzettamento.
Si tratta di un test qualitativo che
esamina risposte difensive correlate
allo stimolo nocicettivo.
Consiste nel pinzettare l'orecchio, la
coda o la zampa di un ratto e
valutare la risposta
che
ne
consegue.
Viene valutata in unità arbitrarie (+,
++, 0) la reazione di un animale allo
stimolo nocicettivo. Sensibile agli
oppioidi.

Test del filamento di Von Frey

Metodi meccanici ...
Test del filamento di Von Frey
Area da testare
Usato per valutare la sensibilità cutanea nel dolore neuropatico,
post-operatorio e in caso di infiammazione
La risposta allo stimolo (ritrarre la zampa) dipenderà dal tipo di
filamento usato, dal ceppo di animali e dal protocollo
utilizzato.

Test Randall-Selitto

Metodi meccanici ...
Test Randall-Selitto
Consiste nel provocare una reazione infiammatoria locale in una delle
zampe posteriori del ratto (iniezione sottoplantare 0,1 ml lievito di birra
in acqua). La soglia del dolore viene valutata con un apparecchio che
esercita una pressione crescente sulla zampa infiammata, espressa come
pressione in grammi.
Il cercare di ritrarre la zampa o un vocalizzo del ratto viene valutato
come end-point.
L'attività analgesica viene
valutata dopo 1, 2, 4h dalla
somministrazione
del
farmaco da testare

Metodi termici: Hot plate test

Metodi termici
Hot plate test
Viene
utilizzato
per
misurare
stimoli
dolorifici di breve durata.
Consiste nell'introdurre un ratto o un topo
in un cilindro aperto superiormente e posto
su una piastra metallica riscaldata ad una t
costante. Questo produce due comporta-
menti che vengono considerati in termini di
tempo di reazione: leccare la zampa e
saltare.

Comportamenti nel test dell'hot plate

Questo comportamento è stereotipato nel topo ma più complesso
nel ratto dove sono stati osservati 12 diversi comportamenti
classificati come movimenti di difesa caotica.
Tabella 1. Etogramma di topi e ratti nel test dell'hot plate
Risposte
Comportamento
al dolore
forepaw licking
hindpaw licking
testicles licking
L'animale si appoggia sulle zampe posteriori e si lecca quelle anteriori
L'animale si lecca le zampe posteriori inclinando la testa
(raro)
di esplorazione/fuga
wall rearing
rearing
jumping
L'animale si appoggia alle pareti del cilindro tenendosi sulle zampe posteriori
L'animale sta eretto sulle zampe posteriori
L'animale salta per evitare il contatto con la piastra calda
(Modificata da: Cirulli et al. In: Balls M, van Zeller AM, Halder ME (Ed.). Progress in the Reduction, Refinement and
Replacement of animal experimentation. Elsevier Science B.V .; 2000)

Modifiche della risposta al dolore con la temperatura

La latenza e la frequenza dei comportamenti mostrati nel test
dell'hot plate si modificano modificando la temperatura.
50
40
T
T
Latenza (s)
30
-
20
10
0
12
T
T
Frequenza
8
T
T
4
0
Forepaw licking
Hindpaw licking
Wall rearing
50℃
52℃
55°℃
Figura 1. Latenza e frequenza di licking delle zampe anteriori, posteriori e di wall rearing in topi
maschi adulti CD-1 esposti a diverse temperature (n .= 24 soggetti in ciascun gruppo)

Influenza della posizione sociale sulla risposta al dolore

La posizione sociale modifica la risposta al dolore.
-Topi alloggiati singolarmente (isolamento sociale) presentano un
aumento della latenza di licking delle zampe rispetto ai loro simili
alloggiati in gruppo.
Effetto dell'isolamento sui livelli di dolore.
50 -
**
T
T
40-
Latenza (s)
30-
T
T
-
20-
T
10-
0
Forepaw licking
Hindpaw licking
52°C - Non isolati (5/gabbia)
55°C - Non isolati (5/gabbia)
52°C - Isolati
55°C - Isolati
Figura 2. Latenza di licking delle zampe anteriori e posteriori in topi adulti CD-1
precedentemente isolati o non isolati, saggiati a diverse temperature
(n .= 24 soggetti in ciascun gruppo) *p<0.05; ** p<0.01

Latenza al comportamento di dolore

Latency to Pain Behavior
50-
40
Latency (sec)
30-
20-
10
0
Vehicle
Morphine
Latency to pain behavior: 30 minutes after treatment with either vehicle or Morphine, mice were
placed on a 52℃ hot plate apparatus to measure the latency of first hind paw pain response. This
response was ellicted by a paw lick, shake or escape jump. Mice treated with Morphine had significantly
increased latencies to respond to thermal stimulation compared to mice treated with vehicle.

Importanza delle relazioni sociali e sensibilità alla morfina

·Importanza delle relazioni sociali
Topi maschi cresciuti a contatto con soli maschi
presentano una minore sensibilità alla morfina rispetto ai loro simili cresciuti con
maschi e femmine.
Alcuni autori non hanno trovato lo stesso effetto.
Sembra che ciò sia dovuto alle differenze nelle popolazioni di
recettori oppiacei presenti nei diversi ceppi di topi presi in esame,
o alle variazioni diurne nell'attività degli oppiacei.
Sono state dimostrate variazioni della sensibilità al dolore nei
diversi ceppi di topi, in particolare nei topi transgenici.
Anche l'età ha importanza nello studio della sensibilità dolorifica.

Considerazioni generali sui test di dolore

Generalmente gli animali vengono testati almeno due volte
prima della somministrazione del farmaco. E dopo la
somministrazione ad intervalli di tempo ben precisi.
E' un test sensibile ai fenomeni di apprendimento. Riduzione del
tempo di reazione.
Il tempo massimo di permanenza sulla piastra è di 45 sec (cut-off
time).
Alcuni farmaci alla dose antinocicettiva modificano la
temperatura corporea e l'attività motoria modificando la
latenza.

Tail flick test

Tail flick test
Viene utilizzato per misurare uno stimolo dolorifico di breve
durata indotto da una radiazione termica.
L'apparecchiatura consiste in una fonte di calore radiante, una
fotocellula, un timer ed un regolatore di potenza calorica.

Applicazione del calore radiante sulla coda

Consiste nell'applicazione del calore radiante ad una piccola
superficie della coda.
L'applicazione di una radiazione termica sulla coda di un
ratto provoca un colpo di coda da cui il nome.
Heat Source
Timer
Heat Intensity Control
Before Tail Flick
After Tail Flick

Tempo di reazione nel tail flick test

Il tempo che intercorre tra l'applicazione dello stimolo ed il
colpo di coda viene considerato il tempo di reazione. Questo
può variare per:
-intensità dello stimolo: più intenso lo stimolo, più breve il
tempo di reazione
-superficie stimolata: aumentando la superficie diminuisce il
tempo di reazione
-sito stimolato
Un aumento del tempo di reazione viene considerato come
azione analgesica.
Il tempo massimo di esposizione al raggio calorico è di 10
sec.

Sensibilità agli analgesici oppioidi e variante del test

Questo test si è rivelato sensibile per gli analgesici oppioidi.
Test attendibile.
Una variante del test è il tail immersion. Consiste
nell'immergere la coda del ratto in acqua ad una determinata
temperatura.
Immersione della coda del roditore
in bagno d'acqua termostatato a
58℃
Cut-off time: 6 sec.