Laboratorio di Genetica: estrazione e analisi degli acidi nucleici

LABORATORIO DI GENETICA

Programma 5 moduli:

1. Estrazione degli acidi nucleici e loro quantificazione
2. Principi alla base delle tecniche di analisi del DNA, cenni di elettroforesi su gel
3. PCR e sue applicazioni
4. Analisi di frammenti
5. Sequenziamento Sanger

MODULO 1 - ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

La maggior parte degli acidi nucleici (DNA e RNA) sono contenuti all'interno del nucleo, che occupa una buona porzione della cellula, sotto forma di cromatina (DNA associato a proteine). La cromatina è circondata da una membrana nucleare molto resistente. Inoltre, il DNA è presente anche nei mitocondri. La cellula è delimitata da un doppio strato fosfolipidico in cui sono integrate anche proteine di membrana. Affinché avvenga l'estrazione degli acidi nucleici è importante che il DNA venga separato dal resto dei componenti cellulari (dalle membrane) e dopo di che venga separato dalle proteine e carboidrati.

Metodi di Estrazione degli Acidi Nucleici

Per estrarre gli acidi nucleici esistono molti metodi, la scelta dipende da vari fattori:

• Dipende dal tipo di acido nucleico che si vuole isolare (dsDNA, RNA totale, mRNA, etc.) - stabilisce quale tipo di protocollo usare.
• Dipende dalla fonte (tessuti vari, cellule da sangue periferico, saliva, urine, tessuto in paraffina, linea cellulare in coltura) -> in base a quale materiale biologico ho a disposizione.
• Risultato desiderato (quantità, purezza, tempo richiesto) -> quanto DNA voglio ottenere, quanto deve essere puro e quanto tempo ho a disposizione.
• Applicazione prevista post-estrazione (PCR, cloning, marcatura, restrizione enzimatica, Southern blotting che richiede una quantità di DNA elevata).

Passaggi Principali della Purificazione

I passaggi principali della purificazione degli acidi nucleici:

1. Rompere la membrana cellulare -> ossia l'involucro che racchiude tutti i componenti cellulari, tra cui DNA e altri acidi nucleici.
2. Allontanamento delle membrane, in modo tale da non portarseli dietro durante l'estrazione degli acidi nucleici.
3. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari, solitamente macromolecole come lipidi, proteine e carboidrati.
4. Precipitazione alcoolica e purificazione: una volta separati, gli acidi nucleici sono in una soluzione acquosa e a questo punto devo isolare il DNA rispetto agli altri e quindi faccio precipitare il DNA, lo rendo insolubile in soluzione e l'insolubilità mi permette di vederlo e separarlo rispetto al resto.
5. Alla fine dell'estrazione è fondamentale fare un analisi qualitativa e quantitativa del DNA estratto.

Rottura della Parete e/o Membrana Cellulare

La solubilizzazione delle membrane avviene in maniera semplice: le membrane sono costituite da un doppio strato lipidico che viene solubilizzato con dei detergenti, ovvero molecole con testa polare e una coda apolare, che si inseriscono nel doppio strato lipidico creando delle micelle chefanno si che la membrana non rimanga integra ma si solubilizzi in tante piccole componenti. Il detergente più comunemente utilizzato è il SDS (sodio dodecil solfato).

Ø È fondamentale che la cellula e la membrana cellulare sia accessibile al detergente. Se ho un campione di tessuto che ha le cellule all'interno di una matrice (es. collagene), esse non sono direttamente accessibili al detergente e quindi devo renderle accessibili tramite lo smembramento del tessuto utilizzando: metodi meccanici, enzimi come collagenasi, vibrazioni o degli step di congelamento e scongelamento che vanno a rompere la matrice.

Una volta estratto il DNA ottengo un DNA che non è integro. Il DNA genomico nella cellula è costituito da 46 cromosomi, a due a due uguali. I cromosomi hanno dimensioni molto grandi nell'ordine delle megabasi. Quindi quando si estrae il DNA è impossibile riuscire ad estrarre i cromosomi integri perché qualunque passaggio attraverso una pipetta frammenterebbe il DNA. Il livello di frammentazione dipende dalla tecnica usata per la frammentazione.

Affinché ci sia una buona estrazione è sufficiente che il DNA si trovi in frammenti che vanno dalle 50 alle 100 kilobasi (kb), non si ottengono frammenti di DNA più lunghi.

Tecniche Principali di Estrazione del DNA

Le principali tecniche di estrazione del DNA sono:

• Estrazione Fenolo/Cloroformio -> Estrazione utilizzando una soluzione contenete fenolo e cloroformio che permette di ottenere un DNA di ottima qualità, che si separa dal resto dei componenti quindi molto purificato, ma è una tecnica molto laboriosa e tossica.
• Estrazione utilizzando il Salting out -> ossia con l'utilizzo di una soluzione contenente un'alta concentrazione di sali che permette la purificazione del DNA; è una tecnica economica e non tossica.
• Colonnine di silice -> Sono dei kit commerciali che prevedono tempi ridotti di estrazione a discapito della quantità e qualità del DNA estratto.
• Beads magnetiche -> si utilizzano delle biglie magnetiche.

ESTRAZIONE FENOLO/CLOROFORMIO

1. Fase di Lisi Cellulare

Attraverso l'utilizzo di:

• Soluzioni contenenti detergenti (SDS o Triton X-100) per solubilizzare le membrane cellulari.
• Utilizzo della proteasi K, un enzima in grado di idrolizzare il legame peptidico; questi enzimi proteolitici poi devono essere eliminati, perché le varie proteasi potrebbero eliminare tutti gli enzimi che verranno usati inseguito.

La purificazione del lisato dalle proteine è importante perché in questo modo si vanno ad eliminare tutti gli enzimi che potrebbero degradare gli acidi nucleici e anche le proteine che potrebbero legare covalentemente gli acidi nucleici, impedendone la purificazione.

2. Fase di Separazione degli Acidi Nucleici dalle Proteine

2. Fase di separazione degli acidi nucleici dalle proteine utilizzando la soluzione di fenolo/cloroformio

Il fenolo è un forte denaturante delle proteine, le lega mediante legami a idrogeno alterandone la struttura. Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici esposti, diventano solubili nella fase fenolica oppure precipitano all'interfase fenolo-acqua.

Se io vado a centrifugare la soluzione contenente acidi nucleici + fenolo/cloroformio ottengo tre fasi:

I. Fase organica inferiore -> che contiene il fenolo. II. Interfaccia -> che contiene le proteine coagulate. III. Fase acquosa superiore -> che contiene gli acidi nucleici.

Centrifugazione Strato acquoso (DNA + RNA) Interfaccia (proteine coagulate) Fenolo Estratto cellulare Miscela con fenolo Separazione degli strati mediante centrifugazione

A questo punto vanno eliminate le proteine e la fase organica, ossia quella del fenolo. Bisogna prendere la componente acquosa senza intaccare l'interfaccia, e la si inserisce in una provetta pulita. Nella provetta pulita avremo la componente acquosa, leggermente contaminata dall'interfaccia proteica e la fase fenolica, in cui ci sono gli acidi nucleici non ancora visibili. Per isolare gli acidi nucleici e lavarli da tutte le sostanze bisogna aggiungere una soluzione di sodio acetato, ossia un catione monovalente, ed etanolo assoluto (100%) molto freddo.

3. Precipitazione del DNA in Etanolo Assoluto

3. Precipitazione del DNA in etanolo assoluto in presenza di sali

Questa fase prevede la presenza di sali ad elevata concentrazione (100-500 mM), fondamentale per concentrare la soluzione di DNA ed eliminare i residui di fenolo/cloroformio.

Ill fase Sodio acetato Etanolo assoluto

4. Lavaggio in Etanolo 70%

4. Lavaggio in etanolo 70% che permette di rimuovere i cationi monovalenti

Una volta aggiunto il sodio acetato e l'etanolo assoluto, il DNA diventerà una matassina visibile.

A questo punto il DNA deve essere lavato dai sali usati per la precipitazione, si lava utilizzando una soluzione di etanolo 70% che ha una duplice valenza: il 70% di etanolo serve per mantenere precipitato il DNA, mentre il 30% di acqua serve per mandare in soluzione i sali usati per la precipitazione e di eliminarli.

IV fase Recupero DNA e lavaggio con etanolo 70%

Si aggiunge etanolo e una soluzione di sali

Si centrifuga e si rimuove il liquido

Soluzione di DNA

Precipitazione di DNA

Si ottiene un DNA molto puro, ma il fenolo è un composto tossico e molto volatile, perciò, bisogna utilizzarlo sotto cappa.

Il DNA in soluzione acquosa, per poterlo precipitare bisogna aggiungere una soluzione salina concentrata e l'etanolo 100%. La quantità disali da utilizzare è circa 1/10 rispetto al volume in cui il DNA è sospeso e la quantità di etanolo è circa 2 volte rispetto al volume in cui era sospeso. Una volta aggiunta la soluzione salina e l'etanolo 100%, avviene una centrifugazione ad alta velocità che fa precipitare il DNA in fondo alla provetta che permette di lavarlo con l'etanolo 70%.

ESTRAZIONE SALTING OUT

Prevede una lisi delle cellule mediante detergenti e trattamento con proteasi K, ma le proteine vengono allontanate non più utilizzando il fenolo, ma utilizzando una soluzione altamente salina. Dopodiché si ottiene sempre la precipitazione del DNA utilizzando una soluzione di etanolo 100%.

Lisi cellulare con detergenti e proteinasi K

Aggiungo Alta concentrazione NaCI (6M)

Recupero DNA e lavaggio con etanolo 70%

Anche in questo caso ho una lisi con detergente e proteinasi K e in seguito aggiungo una soluzione contenente NaCl ad una concentrazione 6M (concentrazione molto elevata, sovrasatura, ovvero il sale oltre una certa concentrazione non riesce a andare in soluzione), il DNA rimarrà in soluzione, ma dopo la centrifuga sul fondo della provetta vedremo la presenza delle proteine che precipitano, perché non riescono a stare in una soluzione così tanto concentrata di sale. A questo punto si recupera la fase acquosa priva delle proteine e si deposita in una provetta pulita e con l'aggiunta di etanolo 100% si fa precipitare il DNA e poi si pulisce con l'etanolo 70% per eliminare tutto il sale utilizzato per far precipitare le proteine.

Solubilità delle Proteine e Concentrazione del Sale

Questo metodo si basa su una diversa solubilità delle proteine a seconda delle concentrazioni del sale:

A basse concentrazioni di sali, le proteine sono scarsamente solubili nell'acqua pura e la loro solubilità aumenta a mano a mano che si instaurano delle interazioni tra gli ioni e la superficie delle proteine (salting in). Ad alte concentrazioni di sali, a causa delle interazioni tra gli ioni salini e l'acqua diminuisce l'idratazione sulla superficie delle proteine, portando alla loro aggregazione e precipitazione (salting out).

Solubility Hydrate shell Salting in Salting out Salt concentration

Sull'ascissa c'è la concentrazione del sale e in ordinata la solubilità delle proteine. A basse concentrazioni del sale la solubilità delle proteine cresce, fino ad una determinata concentrazione di sale, dopodiché la solubilità diminuisce finché non diventa pari a zero. Aumentando la concentrazione del sale la solubilità diventa bassissima e precipitano nella provetta.