Tecniche immunologiche: dosaggi di immunobinding e Western Blotting

Università San Raffaele Roma

Valeria D'Argenio

Università San Raffaele Roma Professore Valeria D'Argenio Argomento Tecniche ImmunologicheT

Dosaggi di Immunobinding

Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio Dosaggi di Immunobinding

• Sono dosaggi in fase solida che si eseguono con antigeni immobilizzati per determinare il contenuto di anticorpi di un campione
• In questo caso si possono utilizzare due diversi metodi:
  1. il metodo competitivo
  2. Il metodo del doppio anticorpo

ELISA

Enzyme Linked Immunoassorbant Assay

Tecniche Immunologiche 2 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio Dosaggi di Immunobinding

Metodo competitivo

1. Metodo competitivo

   · Si fa reagire una quantità nota di antigene marcato con un enzima e una quantità ignota dello stesso antigene libero, con uno specifico anticorpo legato ad una fase solida . Sul sito di legame dell'anticorpo si crea competizione tra l'antigene marcato e quello "freddo", cioè non marcato · Dopo aver lavato il complesso con tampone, si aggiunge il substrato dell'enzima e si misura l'attività enzimatica . In condizioni standard, l'attività enzimatica misurata è proporzionale alla frazione di antigene marcato presente nella miscela · La differenza tra questo valore e quello di un campione in cui si è omesso l'antigene libero rappresenta la misura della concentrazione di antigene nel campione ignoto

Tecniche Immunologiche 3 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio Dosaggi di Immunobinding

Metodo non competitivo del doppio anticorpo

1. Metodo non competitivo del doppio anticorpo

   · Si fa reagire una soluzione ignota di antigene con un anticorpo specifico legato ad una fase solida, si lava e si aggiunge un secondo anticorpo · Questo anticorpo dovrà essere policlonale per legarsi ad un diverso epitopo dell'antigene · Dopo un secondo lavaggio si aggiunge il substrato dell'enzima . L'attività enzimatica dosata in condizioni standard, sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente

Tecniche Immunologiche 4 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

O Tecniche Immunologiche 5 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

ELISA non competitivo

• La tecnica usualmente si effettuata su piastre a 96 pozzetti
• Si svolge in 4 step:
  1. Dapprima si lega l'Ag alla piastra. Il legame è dovuto alle interazioni idrofobiche tra le proteine e la plastica
  2. I siti di legame sulla piastra vengono quindi saturati con proteine aspecifiche (Albumina bovina: BSA)
  3. Si incuba con il primo Ab, poi con l'Ab secondario legato alla perossidasi
  4. Si incubano quindi i substrati e si blocca la reazione prima di effettuare la lettura spettrofotometrica

Tecniche Immunologiche 6 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

ELISA non competitivo: Passaggi

1. Load student samples (unknowns) in triplicate into wells of the microplate strips. Incubate for 5 minutes. Rinse.
2. Add primary antibody to all wells. Incubate for 5 minutes. Rinse.
3. Add enzyme-linked secondary antibody to all wells. Incubate for 5 minutes. Rinse.
4. Add enzyme substrate to all wells. Incubate for 5 minutes.

Tecniche Immunologiche 7 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

ELISA non competitivo: Schema

3 4 5 6 7 8 9 10 12 + + = + Tecniche Immunologiche 8 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

SOLID PHASE BIO-TEK INSTRUMENTS FL500

Microplate Fluorescence Reader

. Select non-overlapping Gliters for excitation / emission. . Llp to & filter seci and associsted sensitivities can be defined per microplate sonn . To read smalticolor Buorescence, select the right filters and sensitivity for nach floorophore or dye . To find the optimal filter set, choose a variety of filters and set the sensitivity at PORTA:chú midrange level. . For optimal sensitivity, set all Gline sets the same, and select a Range of sensitivities such as 2, 5, 7 and 9 . . Two sensitivity ranges may be needed to bracket the entire range of the experiment Tecniche Immunologiche 9 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Reagenti e funzione

PBS, Tween 20, Microplates

Quali sono i Reagenti e che funzione hanno? PBS: Phosphate buffered saline - provides stable buffered environment to maintain antibody structure Tween 20: Nonionic detergent - removes non-specifically bound proteins to reduce background and blocks protein binding sites on the polystyrene Microplates: Polystyrene - proteins absorb (bind) by hydrophobic bonds to the polystyrene Tecniche Immunologiche 10 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Antigen, Primary antibody, Secondary antibody, Enzyme substrate

Quali sono i Reagenti e che funzione hanno? Antigen: Chicken gamma globulin Primary antibody: Polyclonal anti-chicken antibody made by rabbits Secondary antibody: Polyclonal anti-rabbit antibody made by goats linked (conjugated) to horseradish peroxidase (HRP) Enzyme substrate: 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine (TMB) - a colorless solution that when oxidized by HRP turns blue Tecniche Immunologiche 11 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Protocol - ELISA on simulated urine samples

Real-World Application - Pregnancy Test

Tube Description Actual Tube Contents Simulated Tube Contents Student samples Antigen or PBS Patient's urine sample Primary antibody Primary antibody Antibody against hCG hormone from mice Secondary antibody Secondary antibody HRP-linked antibody against mouse antibodies Positive control Antigen Purified hCG hormone Negative control PBS Urine from woman that is not pregnant Tecniche Immunologiche 12 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Control Test

Y . Antigen (hCG) Colored Anti-hCG Antibody Fixed Anti-hCG Antibody Fixed Secondary Antibody AAR Negative Tecniche Immunologiche 13 di 44 Positive - Capillary ActionT

RIA

Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio RIA

• La tecnica è essenzialmente simile alla tecnica ELISA
• Sembra che ora più utilizzata rispetto alla tecnica ELISA verso cui ha vantaggi e svantaggi
• VANTAGGI: tecnica più sensibile, risultati affidabili in un range di concentrazioni maggiore
• SVANTAGGI: utilizzo di radioattivi, utilizzo di apparecchiature più costose per la lettura dei risultati, maggior costo

Tecniche Immunologiche 14 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

RIA TECNICA

• Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti anticorpali
• Solitamente l'antigene viene marcato con 125I
• E' necessario costruire prima di tutto una curva di legame tra l'anticorpo rispetto all'antigene marcato, questo per stabilire le concentrazioni adatte di antigene ed anticorpo marcato da usare nel dosaggio

Tecniche Immunologiche 15 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

RIA TECNICA: Reazione e Separazione

• Quindi si fa reagire una quantità nota di antigene marcato (AgI) e di antigene non marcato (Ag) con l'anticorpo (Ab). Si formano quindi complessi Ag/Ab e AgI/Ab, in eccesso di Ag e si avrà parte di Ag freddo e di Ag marcato liberi. A questo punto è necessario separare le specie legate da quelle libere, su ciascuna delle quali deve essere misurata la radioattività
• L'antigene libero può essere separato mediante cromatografia a scambio ionico, oppure adsorbimento al carbone attivato o alla silice. Il complesso Ag/Ab può invece essere separato utilizzando un anticorpo che reagisca con l'anticorpo complessato formando un precipitato oppure si può separare mediante precipitazioni con solventi o sali opportuni

Tecniche Immunologiche 16 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

RIA Step by Step

1. Allergen specific IgE.

   The serum sample is incubated with an allergen disc. During this step,IgE molecules with specificities for the various allergenic components bind to the allergen dise.

2. Allergens

   Proteins non-specifically bound are washed away with a buffer containing detergent. Only specifically boundIgE remains on the disc.

3. Labeled anti-IgE

   Unbound antibody is washed away with buffer containing detergent.

4. The disc is incubated with labeled anti- humanIgEantibody, which binds specifically to thelgEon the disc. The amount of labeled antibody bound is directly proportional to the amount oflgE present on the disc.
5. SpecificlgEisquantitatedeither through the reaction of labeled antibody with an enzyme substrate (EIA), or by counting radioactivity (RAST).

Tecniche Immunologiche 17 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

RIA: Utilizzo di anticorpi legati e curva di taratura

• E' possibile utilizzare per il RIA anche anticorpi legati alle pareti della provetta utilizzata per il dosaggio, in questo caso basta centrifugare ed eliminare l'antigene non legato
• Variando la concentrazione di Ag freddo e mantenendo costante Agl e Ab si può costruire la curva di taratura, riportando la radioattività legata/radioattività libera contro la concentrazione nota di Ag. Dalla curva di taratura si può poi calcolare la concentrazione di Ag sconosciuta

Tecniche Immunologiche 18 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Radioimmunoassay (RIA)

REAGENTS

Ab specific for hormone (coating the filter) Unknown sample with hormone Y POSITIVE SAMPLE high level of hormone NEGATIVE SAMPLE low level of hormone Allow time to react Wash away unbound substances YYY REAGENTS: 125I-labeled hormone Allow time to react Wash away unbound radiolabeled hormone

PROCEDURE e RESULT

PROCEDURE: measure radioactivity in a gamma counter RESULT: amount of radioactivity is inversely proportional to the concentration of hormone in the sample. Tecniche Immunologiche 19 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Blotting

Trasferimento di macromolecole su una membrana immobilizzante

• Southern DNA - da Edward Southern 1970
• Northern RNA
• Western Proteine

Tecniche Immunologiche 20 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Western Blotting

Sistema e Processo

Questo sistema unisce: - La risoluzione delle separazioni elettroforetiche - La sensibilità delle rivelazioni immunochimiche Miscela di proteine A Incubazione con Ab marcato anti-A Elettroforesi Blotting B - Incubazione con Ab marcato anti-B SDS-Page Filtro Autoradiogrammi Tecniche Immunologiche 21 di 44T Università San Raffaele Roma Valeria D'Argenio

Western Blotting: Scopo

SCOPO DEL WESTERN BLOTTING

Consente la ricerca dell'ago nel pagliaio! Tecniche Immunologiche 22 di 44