Telomerasi e sistemi di riparazione del DNA, Università degli Studi di Milano

La telomerasi

La scorsa lezione stavamo parlando dei telomeri, in particolare abbiamo descritto cosa sono i telomeri (ovvero le parti terminali dei cromosomi lineari), qual è la loro sequenza, e abbiamo visto che, poichè parte del telomero viene perso ad ogni ciclo replicativo a causa di come è strutturato il processo di replicazione, esiste un meccanismo per allungarlo. Questo processo è reso possibile da un enzima ovvero la telomerasi,

La replicazione delle estremità dei cromosomi lineari

Le estremità dei cromosomi devono avere caratteristiche tali per cui vengano evitate:

1. la perdita di informazione genetica
2. la fusione con altre molecole di DNA
3. la degradazione da parte delle desossiribonucleasi

=> i cromosomi degli eucarioti presentano alle estremità delle sequenze costituite da brevi ripetizioni in tandem, chiamate telomeri.

All'interno di grossi gruppi sistematici le sequenze delle ripetizioni sono identiche (ad esempio nei vertebrati TTAGGG) e generalmente sono ricche in GC Il numero di ripetizioni dell'unità di base varia da specie a specie, da un cromosoma all'altro della stessa specie e anche nello stesso cromosoma in tipi differenti di cellule. Nelle normali cellule somatiche umane (non cancerose) i telomeri contengono comunemente da 500 a 3000 ripetizioni che si accorciano gradualmente con l'età (al contrario di quelli della linea germinale e di quelli delle cellule cancerose).

AATCCCAATCCCAATCCC TTAGGGTTAGGGTTAGGG Human telomeres contain thousands of repeats of the six nucleotide sequence, TTAGGG

che è un complesso ribonucleoproteico, costituito da una parte proteica che è una trascrittasi inversa e svolge i meccanismi di sintesi e allungamento del terminale 3', e una parte di RNA che funge da stampo per la trascrittasi inversa. Questo processo avviene in diversi passaggi:

1. Allungamento dell'estremità 3' del filamento che fa da stampo da parte della telomerasi.
2. Sintesi del filamento complementare da parte del meccanismo di replicazione. Il filamento ha un tratto di DNA che il replicone può sintetizzare in maniera convenzionale.

Funzionamento della telomerasi

telomerasi traslocazione RNA telomerasi 5 TAGGGTTAGGG 3' sintesi del DNA AATCCCAAT SI TTAGGGTTAGGGITA 3 sintesi del DNA ripetizione AAT CCCAAT 5 ITAGGGTTAGGGITA - traslocazione AATC ITAGGGITAGGGITAGGGTTA 3'

La telomerasi incorpora il suo stesso stampo: essa usa la sua componente di RNA per ibridarsi al terminale 3' del DNA a singolo filamento del telomero e utilizza la sua attivita' di trascrittasi inversa per sintetizzare una sequenza di DNA complementare all' RNA stampo. Poi l' enzima si stacca, scivola sul telomero in direzione 3' (della catena in allungamento) posizionandosi in modo da re-iniziare il processo. Watson et al., Biologia molecolare del gene 7"ED Zanichelli

Quindi una volta che la telomerasi ha allungato l'estremità 3' (siamo ancora a livello del singolo filamento), si procede alla sintesi del filamento complementare, ovvero il filamento lento. Ovviamente l'ultima parte del filamento 5' verrà degradata, perché abbiamo il primer a RNA; quindi alla fine di tutto il processo rimarrà comunque un'estremità 3' 1 AAT CCCAprotrudente, e ha una lunghezza che varia da 50 a 200 nucleotidi (nell'uomo è abbastanza lunga).

Quindi abbiamo risolto il problema della perdita del materiale genetico perchè abbiamo allungato l'estremità, ma non abbiamo ancora risolto il problema di come proteggere le estremità, perchè le estremità possono:

1. sia essere il substrato di riboesonucleasi, che le attaccano alle estremità e le degradano

La lunghezza dei telomeri è regolata

Telomero Telomero - niverska Megli Studi di Milano

Secondo l'ipotesi corrente la maggior parte delle cellule somatiche hanno un corredo completo di ripetizioni telomeriche. Ad ogni divisione cellulare, percio', i telomeri si accorciano di circa 50-200 nucleotidi. Dopo un certo numero di divisioni la lunghezza dei telomeri diventera' insufficiente per garantire una corretta replicazione dei cromosomi e le cellule smetteranno di dividersi. In questo modo ogni cellula ha un potenziale replicativo definito e dopo un certo numero di divisioni va incontro alla senescenza replicativa.

1. sia potrebbe essere interpretata come un danno al DNA che deve essere riparato e, dato che la cellula cerca di rimediare, prova a legare questa estremità ad altre estremità libere (e sarebbe deleterio per la cellula)

L'obiettivo è quindi quello di proteggere questa estremità. I modi con cui le estremità vengono protette sono diversi:

1. formazione di quartetti G per quanto riguarda l'estremità 3' protrudente. I quartetti G si possono formare perché le sequenze dei telomeri TTAGGG (sono i sei nucleotidi che nei telomeri si ripetono un numero n di volte) sono molto ricche di G. La formazione di quartetti G è un modo per proteggere le estremità perchè hanno una struttura secondaria alternativa che è difficilmente aggredibile dalle nucleasi.
2. inoltre in corrispondenza dei telomeri umani si è osservato che si formano delle particolari strutture chiamate anse T o T loop, in cui l'estremità protrudente si Ansa-t ripiega verso il filamento di DNA, scansando il filamento che normalmente si -POT-1 appaia al DNA nella doppia elica e va ad Centromero 5 3 (TTAGGG)n interagire con la sequenza, questo è ₩ (AATCCC)n possibile perchè dato che si tratta di Complesso TRF-2 sequenze che si ripetono, troverà sicuramente una sequenza ad essa complementare. Complesso TRF-1 Figura 9.31 > Modello di telomero umano stabilizzato dalla for- mazione di un'ansa-t. L'estremità 3' forma un'ansa-t invadendo una ripetizione telomerica a monte e appaiandosi con il filamento complementare. EdiSES Snustad, Simmons Principi di Genetica, IV Ed. FriGES

2C'è quindi proprio uno spostamento del filamento parentale originale, che fisiologicamente di dovrebbe appaiare alla terminazione C2' ma viene scansato e cosi la terminazione può appaiarsi e non è più libera ed esposta all'azione delle nucleasi o ai sistemi di riparazione del DNA. Oltre a tutto questo ci sono diversi i complessi proteici che interagiscono in maniera specifica con il telomero e lo proteggono. Questi complessi si chiamano complessi di Shelterin (complessi di sei proteine che salvaguarda l'integrità dei telomeri, influenzandone struttura e lunghezza).

La replicazione delle estremità dei cromosomi lineari

3° 5 Allungamento TERT TERC Esti A/B COCAAU TIAGOGTTAGGOTTA - 3 AATCCC-S' RINA dela telomeras = Traslocazione in to TTAGGOTTAGGGTTANOCITTA - 3 MATCCC. # Allungamento AATCCO -S 2 Sintesi del Niamento ritardato Formazione dell'ansa T = Figura 6 22 Meccanismo d'azione delta telorserasi umaia (A) I vari passaggi della reazione sono ampiamente distusai nel testn (II) Lai sporgenza in 3' del telomero può ripiegarsi a formare una tripla elica (ditta ansa a T), osservabile al microscopio electrónico (Fonte: Nikitina, T, Woodcock, C.L. (2004), The Journal af Cel INio- 100 nm Amaldi, Benedetti, Pesole, Plivani Biologia Molecolare Copyright 2011 CEA Casa Editrice Ambrosiana

Abbiamo così risolto il problema della replicazione e della protezione delle estremità dei cromosomi lineari. A parte quella di proteggere le estremità dei cromosomi, quali sono le altre funzioni cellulari che hanno le sequenze telomeriche e le proteine che interagiscono con queste sequenze? Si è dimostrato che i telomeri fungano da orologio molecolare per le cellule somatiche adulte. Questo perché nonostante ci sia questo meccanismo compensatorio, di allungamento del telomero da parte della telomerasi, ma nella maggior parte delle cellule somatiche, l'attività della telomerasi viene spenta. Per questo motivo il telomero è destinato ad accorciarsi sempre di più finchè ad un certo punto arriva ad una lunghezza limite, per cui raggiunta questa lunghezza la cellula smette di replicarsi, e va in quella che viene definita senescenza replicativa. Lo spegnimento della telomerasi è un segnale che i telomeri danno alla cellula per bloccare la sua replicazione.

3Questo processo è stato studiato e osservato nelle cellule in coltura, in particolare nelle colture di cellule primarie ovvero cellule che non sono state immortalizzate, e si è visto che nel caso specifico dei fibroblasti queste cellule riuscivano a replicarsi per un numero limitato di volte, dopo di che i telomeri si accorciano e vanno incontro alla senescenza replicativa. Anche nel caso delle cellule umane si osserva il fenomeno dell'accorciamento dei telomeri, e questo si osserva soprattutto nelle cellule che si replicano, proliferano di più così come le cellule della linea ematopoietica. Si è osservato che i telomeri degli adulti vanno via via accorciandosi con l'età, e in maniera particolare l'accorciamento dei telomeri è legato al processo di invecchiamento molecolare e cronologico. Ovviamente si è anche visto che in queste linee cellulari, una volta che si riattiva l'attività telomerasica, i telomeri venivano allungati e le cellule in coltura uscivano dallo stato di senescenza. Si è quindi subito pensato che la lunghezza dei telomeri potesse essere legata all'immortalità, a un modo per allungare la vita, lo stato di giovinezza, sia delle colture cellulari ma anche degli individui.

Negli organismi pluricellulari non è così, in particolare nell'uomo la lunghezza dei telomeri non è associata all'immortalità, perché nel rendere una cellula capace di replicarsi in maniera indefinita aumenta la probabilità dell'emergere di neoplasie. Si è infatti osservato che nel 90% dei tumori, si ha una riattivazione della telomerasi e quindi un allungamento dei telomeri:

4proprio per questo una delle vie di approccio alla cura sperimentale dei tumori si sta basando proprio sulla possibilità di inibire la telomerasi che si è attivata. Quindi fisiologicamente è bene che i telomeri non siano ne troppo corti rispetto all'età cronologica, né troppo lunghi ma devono avere una lunghezza fisiologicamente utile. La lunghezza dei telomeri oltre che a processi Telomere fisiologici, può essere influenzata anche dall'ambiente esterno, per esempio si è osservato Cell The telomeres form caps at Chromosome the ends of chromosomes. They contain a unique DNA sequence which is repeated several times che uno stato di stress continuo, porta a un accorciamento del telomero, quando la cellula è sotto stress il telomero si accorcia più Telomere velocemente.

Il misterioso telomero

1. The mysterious telomere The telomeres appear to protect the chromosomes from damage. But how? Telomere = Greek for "end" (telos) and "part" (meros) The DNA sequence varies slightly between species. The one shown here is from Tetrahymena. Chromosomes with telomeres Tetrahymena - a single-cell organism that lives in water

Funzione del telomero

2. Telomere function discovered: Telomere DNA protects the chromosomes Telomere DNA Artificial minichromosomes Yeast cell Yeast cell Minichromosomes without telomeres were introduced into yeast cells. They were not protected and were damaged. Telomere DNA was purified from Tetrahymena, coupled to the minichromosomes and introduced into yeast cells. Minichromosomes with telomere DNA were protected against degradation and remained intact.

Sintesi del telomero

3. Telomere synthesis elucidated: Telomerase builds telomere DNA Telomere 0 Telomere DNA is built base by base DNA CCTACTGAACGGGG1 GGATGACTTGCCCC CCCCA C TGGGGT CCCCAA Telomerase Protein RNA template RNA 2 Without telomerase present, the chromosome is shortened each time the cell divides. Finally the telomere DNA is eroded and the chromosome is damaged. Telomerase maintains the telomeres at the ends of the DNA thread. This makes it possible to copy the entire chromosome to its very end each time the cell divides. The Nobel Committee for Physiology or Medicine 2009

In questo grafico è riportato il fatto che si definiscono le malattie legate ad un aberrante lunghezza dei telomeri come thelometers biology disorders (TBD) e c'è proprio una classe di patologie legate alla lunghezza aberrante dei telomeri. Dal grafico si evince che una lunghezza del telomero troppo corta rispetto a quella fisiologica rispetto a una determinata età, sono associate molto frequentemente una sintomatologia degenerativa e anche immunodeficienza proprio di quelle cellule che proliferano più velocemente.

Telomerase operates at the end of the chromosome. It is an enzyme consisting of a protein and an RNA sequence. The RNA serves as a template for synthesizing telomere DNA.

La maggior parte delle sindromi associate a telomeri troppo lunghi, sono le neoplasie come dicevamo prima. Telomeri troppo lunghi o troppo corti possono essere dovuti all'azione di agenti esterni a cui è associata anche una predisposizione genetica, ci sono varianti più o meno comuni che predispongono a una lunghezza più o meno grande. Ad ora uno dei modi per prevedere se un individuo ha telomeri più o meno lunghi è quello di andare a caratterizzarsi per la presenza di alcune varianti genetiche che si è visto essere generalmente associate a un allungamento o un accorciamento del telomero. Anziché andare a misurare direttamente la lunghezza dei telomeri, che non è semplice, ma sono necessarie tecniche molto sofisticate (è una misura molto delicata, difficile da fare ed è difficile trovare il range di normalità relativo ad una determinata metodica rispetto ad un'altra), invece si può andare a vedere la presenza o meno di varianti alleliche.

5 The Telomere - Function and Synthesis Studi