Western Blot: analisi delle proteine e fasi principali della tecnica

Western Blot

Ctr 1 Ctr 2 Ctr 3 Trt 1 Trtl 2 Trt 3 Phospho ERK ERK

IBlotting

Trasferimento di macromolecole su una membrana

• DNA: Southern blot (Edwin Southern, 1975)
• RNA: Northern blot (James Alwine, David Kemp e George Stark, 1977)
• Proteine: Western blot (Neal Burnette, 1979)

Cosa è un Western Blot?

È una tecnica in cui le proteine sono, inizialmente, separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Questa tecnica si usa per rilevare e quantificare proteine che reagiscono con un anticorpo specifico.

• ? + +

Fasi del western blot

Gel cassette Tissue Electrode chamber Add sample + Tank Anode Cathode  Lysate/Extracts Pour Gel and Assambling device Pipet samples and buffer 3 Electrophoresis 4 Separated protein bands 5 1 2) Cathode Buffer Anode Buffer Cell Bacterial I I

FASE 1: Purificazione delle proteine

Estrazione e frazionamento

Una proteina per poter essere purificata deve prima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine mediante procedure di frazionamento opportune. Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea (pura), far sì che la proteina di interesse sia l'unica presente nel campione a disposizione.

Fattori che influenzano la purificazione

• CALORE
• DETERGENTI
• METALLI PESANTI
• PH La solubilità di una proteina dipende dal pH, dall'aggiunta di sali (ammonio solfato) e di solventi organici Per prevenire la denaturazione e la rottura dei ponti disolfuro si usano composti contenenti tioli (mercaptoetanolo, glutatione ridotto e ditiotreitolo) Esistono inibitori di proteasi, ciascuno specifico per una proteasi (a serina, a cisteina, aspartiche e metalloproteasi) e inibitori di fosfatasi.

FASE 1: Purificazione delle proteine

Metodi di rottura delle cellule

Metodi meccanici: · Omogenizzatori · Frantumazione con abrasivi · Presse · Sonicazione DA ASITAM TH

Metodi non meccanici: · shock osmotico : l'acqua fuoriesce dalle cellule quando poste in mezzo ipertonico. Le cellule vengono trasferite in una soluzione ipotonica dove entra acqua e la cellula si lisa. · congelamento/scongelamento : provoca fuoriuscita di materiale intracellulare e disgregazione interna dovuta a formazione di cristalli di ghiaccio. · enzimi litici : causano danneggiamento della membrana/parete cellulare. Le cellule possono subire un blando trattamento meccanico o shock osmotico

FASE 1: Purificazione delle proteine

Dosaggio delle proteine

Misurazione della concentrazione totale delle proteine Saggio colorimetrico di Bradford

0.4 0.3 595 A 595 0.2 0.1- 0.04 0 2 4 6 8 10 Concentrazione proteina (ug ml-1)

FASE 2: Elettroforesi

Tecnica che permette di separare particelle dotate di cariche elettriche positive o negative, in base alla loro migrazione differenziale attraverso un mezzo fluido, sotto l'influenza di un campo elettrico. La ionizzazione del gruppo carbossilico dà luogo alla formazione di cariche negative, mentre l'assunzione di protoni sul gruppo amminico determina la presenza di cariche positive.

• Ogni molecola proteica posta in soluzione ad un certo pH potrà avere una prevalenza di cariche elettriche positive (catione) o negative (anione) oppure carica totale = 0 (ugual numero di cariche elettriche positive o negative).
• Il valore di pH al quale la proteina ha carica totale =0 costituisce il punto isoelettrico (pI) della proteina.
• A valori di pH<pI la proteina ha una prevalenza di cariche positive e sotto l'influenza di un campo elettrico migra verso il polo negativo (catodo).
• A valori di pH>pI la proteina ha una prevalenza di cariche negative e sotto l'influenza di un campo elettrico migra verso il polo positivo (anodo).
• A valori di pH=pI la proteina ha una carica netta = 0 e sotto l'influenza di un campo elettrico non migra.

Elettroforesi

• Il passaggio di corrente elettrica attraverso il gel permette la migrazione delle proteine (caricate negativamente a pH >8) verso l'anodo.
• La porosità del gel determina la resistenza al passaggio delle molecole, quelle di maggior dimensioni saranno più rallentate.

Proteine Gel poroso Elettroforesi

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE

Sodium-Dodecyl-Sulphate PolyAcrilammide Gel Electrophoresis

• L'SDS è un detergente che carica negativamente le proteine
• E' un gel denaturante: non evidenzia strutture quaternarie
• Separazione di proteine in base alla massa molecolare
• Determinazione della massa molecolare
• Western blot

0 II Na+ 0-S-0-(CH2)11CH3 II 0 Sodium dodecyl sulfate (SDS)

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE e ruolo dell'SDS

Nell'SDS-PAGE le proteine vengono esposte al Sodio Dodecil Solfato (SDS) prima e durante l'elettroforesi

+ + - - - H H + + +- - - H - - + -

Ruolo dell'SDS: le proteine multimeriche si dissociano nelle loro subunità: sono forzate in conformazioni estese tutte le catene polipeptidiche assumono la stessa DENSITA' DI CARICA. Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma e carica, quindi l'unico determinante della velocità di migrazione sarà il PESO MOLECOLARE.

FASE 2: Elettroforesi

Migrazione e separazione delle biomolecole

Le molecole di grandi dimensioni migrano in genere più lentamente di quelle piccole: ciò permette la separazione delle diverse biomolecole all'interno del gel. I gel di poliacrilammide si fanno a concentrazioni diverse di acrilammide: le dimensioni dei pori diminuiscono all'aumentare della sua concentrazione (%).

5 % 10 % 15 % -200 kD - 75 kD - 35 kD - 120 kD - 50 ŁD - 25 kD - 35 k:D - 75 kD - 25 KD - 15 kD 50 kD - 15 :D - 10 kD .

• 200 kDa - 70 kDa gel al 6-8%
• 80 kDa - 50 kDa gel al 8-10%
• 45 kDa - 20 kDa gel al 15-20%

FASE 2: Elettroforesi

Polimerizzazione del gel

Polimerizzazione S2Og -- SO .-. 0 TEMED 0 TEMED CONH2 CONH2 SO4 -· + A . HỌC= NH, HỌC NH, CONH2 H,NOC S2Og -- SO4 -· 0= 0 0 H2 NH NH SO4 -* + + H2C= N N =CH2 HỌC= NH2 1 NH NH O O= H,NOC

I gel di poliacrilamide si formano dalla co-polimerizzazione di acrilamide e di un agente che forma legami trasversali (N,N'- bisacrilamide) a formare un reticolo tridimensionale

Poly Acrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)

• Acrilamide monomero (neurotossico)
• N,N'-bisacrilamide (BIS) ramificante
• Ammonio persolfato (APS) forma radicali
• N,N,N,N-Tetrametil- Etilenediamina (TEMED) stabilizza i radicali

CH3 N H3C. CH3 N CH3 H,C= NH 0 O H, C. H2C= Z- N =CH2 H H (NH4)2S2Og H H . 0 TEMED

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE: Gel di impacchettamento e separazione

• Gel di impacchettamento (stacking gel) 4% di acrilammide pH 6.8
• Serve per concentrare le proteine in una sottile banda prima della separazione
• Si sfrutta una forza ionica ed un pH differenti rispetto al tampone elettroforetico ed allo stacking gel
• Pori larghi per una libera migrazione e concentrazione
• Migliora la risoluzione
• Gel di separazione (running gel) pH 8.8 Le percentuali di acrilammide variano:
• 15% per proteine di peso molecolari tra 10.000-100.000 Da
• 10-7.5 % per proteine di peso molecolare maggiore di 100.000 Da

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE: Allineamento e separazione

Stacking gel allineamento Separating/running gel separazione

Negative Electrode Load samples here Buffer well well well Stacking Gel Running Gel big proteins J Glass Plates Positive Electrode 1 Spacer small proteins Buffer An illustration of an apparatus used for SDS PAGE. Sample JUUUU Direction of migration + (a)

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE: Preparazione

Preparazione

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE: BIO-RAD

BIO-RAD ead st gels FB (WP) A

FASE 2: Elettroforesi

SDS-PAGE: Esempio di migrazione

Sample € Direction of migration 0 (a) 1 2 e Myosin 200,000 B-Galactosidase 116,250 Glycogen phosphorylaseb 97,400 Bovine scrum albumin 66,200 Ovalbumin 45,000 - Carbonic anhydrase 31,000 Soybean trypsin inhibitor 21,500 Lysozyme 14,400 + Unknown M. standarde protein (a)

FASE 3: Rivelazione e stima delle proteine da gel

• Colorante
• Affinità uguale per tutte le frazioni proteiche
• Proporzionalità diretta tra assunzione di colore e concentrazione di proteina
• Sensibilità . Comassie Brilliant Blue · Rivela fino a 0.1 mg di proteine · Silver staining · Ag+ -- > Ag sulla proteina · Rivela fino a 0.1 ng

A ¥536 SPD added (M) WT 10- 10-7 10-# 10-9 M +- 52 kDa - 31 kDa - 19 kDa £17 kDa + 11 kDa Coomassie stain gel B SPD added (M) Y536 WT 10-6 10-7 10- 10-9 M +-52 kDa +31kDa +-19 kDa +17 kDa +11 kDa Ponceau-S stain

FASE 4: Trasferimento

Tipologie di Blotting

• Wet Transblot system
• Semidry system MEDIUM

FASE 4: Trasferimento

Come preparare il sandwich

Come preparare il sandwich

FASE 4: Trasferimento

Preparazione del sandwich per il trasferimento

Come preparare il sandwich spugna filtro catodo 0 gel corrente membrana filtro + spugna anodo

FASE 4: Trasferimento

Apparato WET TransBlot

Trasferimento su carta Casting nero

Partendo dal casting nero: · 1 spugna · 2 fogli di carta · Gel

Casting bianco

• Membrana
• 2 fogli di carta
• 1 spugna

Nell'assemblaggio si colloca nero nella direzione del nero, bianco nella direzione del rosso. Le proteine, cariche negativamente, corrono verso il polo positivo

FASE 4: Trasferimento

BIOTEAD

BIOTEAD Dott.ssa Angelucci C.B.

FASE 4: Trasferimento

Componenti dell'apparato di trasferimento

Lid Fiber pad Filter paper Membrane Gel Filter paper Fiber pad Gel holder cassette Blue cooling (keep frozen at -20℃) Electrode module Buffer tank

FASE 4: Trasferimento

00000000000000/ 00000000000000/

FASE 4: Trasferimento

Schema del trasferimento

Filter paper Filter paper Proteins- O + Foam pad Polyacrylamide gel Nitrocellulose membrane Foam pad

FASE 4: Trasferimento

Disposizione degli elementi per il trasferimento

Gel Membrana Carta assorbente Spugna - Catodo O- + Anodo Tampone di trasferimento

FASE 4: Trasferimento

FASE 4 : TRASFERIMENTO

FASE 4: Trasferimento

Configurazioni per 4 e 2 gel

4 Gels 2 Gels

FASE 4: Trasferimento

Trasferimento nell'apparato Semidry system

Electrical Contact Electrical Contact Metal Spacer 2 Lid with vents Power Cord IBlot" Gel Barriers Gel Barriers De-bubbling Surface Blotting Surface è invitrogen Start/Stop Button Metal Spacer 1 Alignment Guide

FASE 4: Trasferimento

Trasferimento Semidry system

Trasferimento nell'apparato Semidry system Carta assorbente - Catodo Corrente O O C Gel Proteine > V Membrana + Anodo

FASE 4: Trasferimento

FASE 4 : TRASFERIMENTO

FASE 4: Trasferimento

FASE 4 : TRASFERIMENTO

FASE 4: Trasferimento

Trasferimento nell'apparato Semidry system

3. Trasferimento nell'apparato Semidry system Transfer Move proteins from gel to membrane

FASE 4: Trasferimento

Confronto tra i due sistemi di trasferimento

Confronto tra i due sistemi Spugna-cassetta - Carta da filtro Gel Membrana ++ Tampone Apparato Semidry WET Trans Blot

Vantaggi: veloce, economico (meno buffer) Svantaggi: efficienza di trasferimento limitata (dimensione gel, % acrilammide, peso molecolare)