La duplicazione del DNA: meccanismo replicativo e sintesi

La duplicazione del DNA

La molecola di DNA è in grado di replicare sè stessa

Dopo aver decifrato la struttura del DNA, fu possibile investigare come il materiale genetico si potesse replicare.

Il primo esperimento fatto per cercare di spiegare in che modo avvenisse la duplicazione del DNA fu svolto da Arthur Kornberg

Egli infatti dimostrò che era possibile sintetizzare un nuovo DNA con la stessa composizione di basi di un DNA di partenza bastava avere a disposizione:

• I 4 nucleotidi nella forma di desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• L'enzima DNA-polimerasi
• Un DNA stampo per guidare l'ingresso dei nucleotidiLa molecola di DNA è in grado di replicare sè

Ma l'esperimento di Kornberg però non spfegavail meccanismo attraverso il quale era possibile ottenere una nuova molecola di DNA.

All'epoca vennero formulate tre diverse ipotesi ...

Modelli di replicazione del DNA

A Dopo un ciclo di replicazione DNA originario In base al modello semiconservativo ciascuna molecola di DNA contiene un intero filamento vecchio e un intero filamento nuovo. B In base al modello conservativo la molecola originaria viene mantenuta e si assiste alla sintesi di un'intera molecola nuova. c In base al modello dispersivo la sintesi del DNA origina due molecole i cui filamenti sono costituiti da frammenti di DNA vecchio e neosintetizzato. Figura 16 Tre modelli per la replicazione del DNA In ciascun modello, il DNA originario è rappresentato in blu, i filamenti neosintetizzati in rosso.La molecola di DNA è in grado di replicare sè stessa.

Meccanismo semiconservativo

La conferma che il DNA si replica attraverso un meccanismo semiconservativo si ebbe grazie agli studi di due genetisti Matthew Meselson e Franklin Stahl nel 1957.

Essi misero in atto quello che viene definito «il più bell' esperimento di biologia»

Matthew Meselson (1930-) a sinistra e Franklin Stahl (1929-) https://www.raicultura.it/articoli/2020/06/Attivita-sullesperimento-di-Meselson-e-Stahl-e91324eb-68ae-4c98-98ba-cf8d208e1a9a.html

Attività di lavoro: dopo aver visionato il link proposto e cercando opportune fonti attendibili in rete, preparate un lavoro multimediale (un power point, un videoclip ... ) in cui spiegate e illustrate l'esperimento di Meselson e Sthal.

Buon Lavoro!La molecola di DNA è in grado di replicare sé stessa.

Fase S del ciclo cellulare

La duplicazione del DNA si verifica durante una particolare fase del ciclo cellulare detta fase S

Il processo è molto rapido: nell'uomo e nei mammiferi vengono posizionati circa 50 nucleotidi al secondo, nei procarioti si arriva anche a più di 500 nucleotidi al secondo !!!

Al momento della duplicazione la molecola si apre lungo la linea mediana come una cerniera lampo e le basi appaiate si separano a livello dei legami ad idrogeno. A mano a mano che i due filamenti si separano essi fungono da stampo.

• Ciascuno dirige la sintesi di un nuovo filamento COMPLEMEMENTARE che avviene grazie a nucleotidi già presenti nella cellula.
• In questo modo ogni filamento forma una copia di quello a cui era appaiato originariamente e vengono prodotte alla fine due copie identiche della molecola iniziale.

filamenti originali filamenti di nuova sintesiLa molecola di DNA è in grado di replicare sé stessa.

Meccanismo di replicazione

Il meccanismo mediante il quale nelle cellule si realizza la duplicazione stessa è molto complesso ... esso infatti necessita di un gran numero di enzimi differenti, ognuno specifico nel catalizzare una particolare fase del processo

wehi.edu.auMeccanismo rep"

Condizioni per la replicazione semiconservativa

La replicazione semiconservativa richiede precise condizioni:

• Nucleotidi trifosfato
• Un DNA preesistente
• Un complesso enzimatico di replicazione
• Un PRIMER ( innesco partenza) O in genere un frammento di RNA come punto di
• Numerose proteine

O 0 - 0-P-O-P-O-P 0- o- H2C 0 Basc ... H H H H HO H - 3 5 3 5 RNA PRIMER 3 ANA POLIMERASi vy 5' NUCLEOTIAi VMeccanismo repl

Tappe della replicazione

La replicazione avviene in due tappe successive:

1. In un determinato punto la doppia elica , ad opera di specifici enzimi, si despiralizza con la conseguente separazione dei due filamento stampo
2. Il legame tra un nucleotide e quello seguente (legame fosfodiesterico) è catalizzato da un enzima detto DNA-POLIMERASI

sito attivo dell'enzima DNA polimerasi 5' filamento stampo dNTP in arrivo 3'Meccanismo replicatix

Allungamento del nuovo filamento

IMPORTANTE 5' CH2OH _O. OH 4' |3' 2' OH H Desossiribosio I nucleotidi si vanno ad aggiungere al nuovo filamento in accrescimento sempre e solo ALL'ESTREMITÀ 3' ovvero quella dove il filamento di DNA presenta un gruppo -OH (ossidrile) libero in posizione 3'del deossiribosio terminale Pertanto l'allungamento del nuovo filamento avviene sempre in direzione 5' [ 3' estremità 5' 0 N NH S'CH O N "NH2 1 3 24 O "O-P-O NH2 1 Ò N N 1 CH2 0 N 2 0 0-P=0 0 H-C NH T CH, N 0 2- 0-P-0 NH2 1 S'CH2 0% N 0 3ª 21 0 estremità 3' A 0-P-0 G C 0Meccanismo replicativo

Vediamo i vari step ...

Step 1: Inizio della replicazione

Step 1. A ori singolo nel cromosoma procariotico 1. La sequenza ori lega il complesso che avvia la replicazione. Complesso di pre-replicazione 2. Due forcelle di replicazione avanzano in direzioni opposte, allontanandosi l'una dall'altra. ori ori ori ori 1 1 B ori multipli nel cromosoma eucariotico ori ori ori Contengono origini di replicazione multiple. 1 Inizio della replicazione 00 200000 1 0000000 Le forcelle si muovono in direzioni nnnncta

• La duplicazione inizia sempre da una specifica sequenza di nucleotidi detta ORIGINE DELLA DUPLICAZIONE.
• Nei procarioti, che possiedono un unico cromosoma circolare , esiste un unico punto di origine (ORI-C in E.Coli, 245 pb), mentre negli eucarioti essendoci la presenza di diversi cromosomi si avranno più punti di origine!Meccanismo replicativo

Enzimi e proteine coinvolte

1. · Questo punto di origine viene riconosciuto da particolari tipi di enzimi detti TOPOISOMERASI che agiscono modificando l'avvolgimento della molecola e ne consentono il rilassamento. · Successivamente l'enzima DNA-ELICASI rompe i legami a idrogeno che tengono uniti i due filamenti · Subito dopo intervengono una classe di proteine particolari dette SSB (single strand binding proteins- proteine leganti il singolo filamento) che si legano ai due filamenti sdrotolati per impedire che si riassocino in una doppia elica Le single strand binding proteins sono proteine che si legano ai filamenti singoli per evitare che si riformi la doppia elica. 5 3 3' direzione della forcella di duplicazione La DNA elicasi si muove lungo uno dei due filamenti in direzione 5'-+ 3' e separa i due filamenti di DNA. La DNA topoisomerasi scorre davanti alla forcella di duplicazione ed elimina la tensione dovuta al superavvolgimento causato dalla DNA elicasi. 5'Meccanismo replicativo

Bolla e forcella di duplicazione

1. · A questo punto si forma quella che viene definita BOLLA DI DUPLICAZIONE ... ovvero una regione a forma di «occhio» in cui avviene la sintesi !!! forcella (o forca) di replicazione forcella (o forca) bolla di replicazione di replicazione 5' 3' 3' 5' proteina iniziatice DNA elicasi · Ad entrambe le estremità della bolla, dove i vecchi filamenti vengono separati e stanno per essere sintetizzati i nuovi, la molecola forma una struttura ad Y nota come forcella di duplicazione LA DUPLICAZIONE AVVIENE IN 2 DIREZIONI OPPOSTE RISPETTO AL PUNTO DI ORIGINE PERCIÒ LA DUPLICAZIONE VIENE DEFINITA BIDIREZIONALE Replicazione Bidirezionale 5' 3 RNA DNA stampo nuovo DNAMeccanismo replicativo

Step 2: Sintesi del nuovo filamento

Step 2. · A questo punto, una volta formata la bolla di duplicazione, si rende possibile l'effettiva sintesi del nuovo filamento grazie all'intervento di un gruppo di enzimi noti come DNA · Nello specifico, in Escherichia coli, intoichmerasiA- polimerasi III. Nei batteri questo complesso enzimatico molecolarmente assomiglia ad una mano «semiaperta», con il palmo che contiene il sito attivo dell'enzima e le 4 dita conformate in modo da riconoscere la forma delle 4 diverse basi nucleotidiche A B Primer di RNA Filamento stampo 3 Nuovo filamento 5' DNA «pollice» DNA polimerasi 3' 5' «dita»Meccanismo replicativo

Funzionamento della DNA-polimerasi III

Come lavora la DNA- polimerasi III · Per poter operare l'allungamento di un filamento polinucleotidico la DNA polimerasi richiede un piccolo innesco un filamento di avvio detto primer. Questo primer è un breve filamento di RNA. · Questo innesco viene sintetizzato da un enzima detto primasi 1. La primasi si lega al filamento stampo e sintetizza un primer di RNA. Primasi Primer di RNA 5' Filamento stampo m in 5' Primer di RNA 3' 5' 5 DNA polimerasi 2. Quando il primer è completo, la primasi si stacca. La DNA polimerasi si lega e sintetizza nuovo DNA. Primasi Nuovo filamento 3 5 3' 5'Meccanismo replicativo

Sintesi sui filamenti antiparalleli

2. · Come abbiamo detto in precedenza la DNA polimerasi lavora in una sola direzione ... C)G OG AT GC TA TA C)G A T C A C TA T T A C) G CG ΣΑΡ AT TA -AT AKT AT GC AKT AT TA TA GC GC 5'13' DI CONSEGUENZA L'ALLUNGAMENTO PROCEDE IN MODO DIVERSO SUI 2 FILAMENTI ANTIPARALLELI DNA GMeccanismo replicativo

Sintesi del neofilamento con estremità 3' libera

VEDIAMO DA VICINO COME VIENE SINTETIZZATO IL NEOFILAMENTO CHE AVRÀ L'ESTREMITÀ 3' LIBERA IN CORRISPONDENZA DELTA FORCEIL AL La sintesi del filamento veloce è continua. 3' 5' 5' 3 3' 5' 5' 3' 3' 3 5 5'

• L'allungamento di questo nuovo filamento avviene in modo continuo in quanto la DNA polimerasi aggiungi nucleotidi senza interruzioni e si allunga nella stessa direzione in cui sposta la forcella FILAMENTO GUIDA -> LEADINGMeccanismo replicativo

VEDIAMO DA VICINO COME VIENE SINTETIZZATO IL NEOFILAMENTO CHE AVRÀ L'ESTREMITÀ 3' LIBERA IN CORRISPONDENZA DELLA FORCELLA !!! (A) 5'-trifosfato 3º HO 3' 5' HO filamento primer deossiribonucleoside trifosfato in arrivo filamento stampo 5' 3' pirofosfato 3' 5° direzione di crescita della catena 5'- 3' HO 5' 3ºMeccanismo replicativo

Sintesi del neofilamento con estremità 5' libera

VEDIAMO ORA DA VICINO COME VIENE SINTETIZZATO IL NEOFILAMENTO CHE AVRÀ L'ESTREMITÀ 5' LIBERA IN CORRISPONDENZA DELLA FORCELLA !!! 3' 5' 5' 3' 3' 3 5' 5'

• Questo filamento dovrebbe allungare in direzione 3' 5' primo per seguire la direzione della duplicazione ma ciò non è possibile per tanto la duplicazione del filamento con direzione 5 primo 3 primo avviene ritrosoMeccanismo replicativo

NEOFILAMENTO CON ESTREMITÀ 5' LIBERA IN CORRISPONDENZA DELLA FORCELLA !!! 3 SI 5- -OH 3' 1 5' - OH HO 3 DOO 5' zucchero 3'5 OH 3' - base 5'0 0 5' -trifosfato IN PRATICA QUESTO FILAMENTO PUNTA NELLA DIREZIONE SBAGLIATA !!! dreamstime dreamstime ONE WAY ONE WAY dreamstime dreamstin amstime amstime