Ingegneria Tissutale: adsorbimento di proteine su biomateriali

Ingegneria Tissutale

PIEN
UNIVERSITÀ
DEL SALENTO
Ingegneria Tissutale
Corso di Laurea in Ingegneria Biomedica
a.a. 2024-2025
Docente: Federica Paladini, Ph.D.
federica.paladini@unisalento.it

Adsorbimento di Proteine su Biomateriali

PIEN
UNIVERSITÀ
DEL SALENTO
Adsorbimento di proteine sulla superficie
di biomateriali
Federica Paladini, Ph.D.
federica.paladini@unisalento.it

Proteine e Ambiente Biologico

• Fra i componenti organici più grandi delle cellule. Ne esistono molte
  migliaia, ciascuna codificata da un gene nel DNA;
• Coinvolte in tutte le funzioni cellulari;
• Possono essere solubili o insolubile nei fluidi corporei:
  Proteine insolubili: funzioni strutturali e di motilità; mediano anche
  le funzioni cellulari;
  V
  Proteine solubili: controllano fortemente la funzione cellulare
  tramite legami, adsorbimento, ecc.
• Sono caratterizzate da un'ampia gamma di pesi molecolari:
  V
  Peptidi: diversi aminoacidi (es. ossitocina, 9 a.a.)
  V
  Polipeptidi: ~ 10-100 a.a. (ad esempio insulina, 30 e 21 a.a.)
  /
  Proteine: ~ 100-1000 a.a. (es. albumina sierica, 550 a.a.)

Funzioni delle Proteine in Ambiente Biologico

• Strutturali: componenti della ECM che supportano fisicamente le cellule,
  (ad es. collagene, elastina, proteine di adesione);
• Enzimi: catalizzano le reazioni.
• Trasporto: legano e trasportano molecole specifiche agli organi o
  attraverso le membrane cellulari (ad es. emoglobina);
• Motilità: forniscono un meccanismo per il movimento cellulare (ad es.
  actina e miosina nei muscoli);
• Difesa: proteine del sistema immunitario e legate al meccanismo della
  coagulazione (ad es. immunoglobuline, fibrinogeno e trombina);
• Regolatori: citochine - regolano le attività cellulari (ad es. ormoni:
  insulina e fattori di crescita).

Struttura delle Proteine

Le proteine sono macromolecole naturali (biopolimeri) costituite da diversi
aminoacidi come unità monomeriche e catene laterali aggiuntive come
fosfati, oligosaccaridi o lipidi; le catene sono assemblate in strutture
gerarchiche.
Side
chain O
-
Amine
group
NH2
-C-
-C-OH
Acid
group
H
a
Amino acid structure
COOH
H-C-H
O
NH2-C-
C-OH
H
O
H
NH2
12
-C-C-OH
Aspartic acid (Asp)
H
Glycine (Gly)
H-C-H
O
=
NH2
-C-C-OH
H
Phenylalanine (Phe)
b Different amino acids, showing their
unique side chains
Amino acids
a Helix
Polypeptide chain
Assembled subunits
Lys
Lys
Gly
Gly
Leu
Val
Ala
His
Primary
structure
Secondary structure
Tertiary structure
Quaternary structure
H
O
N
C
-
4

Domini Superficiali delle Proteine

L'eterogeneità della catena laterale degli amminoacidi si manifesta nelle
proprietà superficiali della proteina:

• carico (acido/basico)
  CARATTERE IDROFILICO
• non carico, polare
• non carico, non polare
  CARATTERE IDROFOBICO
  A titolo di semplificazione, la complessa struttura superficiale delle proteine
  può essere scomposta in singoli domini che esibiscono proprietà specifiche
  come idrofilo/idrofobo, polare/non polare, carico/non carico.

Effetto Idrofobico

L'effetto idrofobico si riferisce all'aggregazione guidata dall'entropia di
molecole non polari in soluzione acquosa che avviene per ridurre al minimo
l'ordinamento delle molecole d'acqua con cui sono in contatto. Questa non è
una forza attrattiva, ma piuttosto un processo guidato dalla termodinamica.
La figura mostra le strutture a
gabbia formate da molecole
d'acqua che circondano un
soluto non polare.
L'effetto idrofobico guida la
formazione delle membrane e
contribuisce al ripiegamento
delle proteine.
Nonpolar
substance
Highly ordered
water molecules
Waters released into bulk
solution
Hydrophobic
aggregation
Lower entropy
Higher entropy

Adsorbimento di Proteine su Biomateriali

L'ADsorbimento è il processo di associazione dei solvati (o del
solvente) a un'interfaccia materiale.

• Perché è importante comprendere e controllare l'adsorbimento delle
  proteine?
• Perché e come vengono adsorbite le proteine?
• Come si comportano le proteine che adsorbono? come singole molecole
  o come insieme?
• A quali regole generali aderiscono i fenomeni di adsorbimento delle
  proteine?
• L'adsorbimento influenza la funzione biologica della proteina?

Meccanismo di Adsorbimento di Proteine

• Trasporto verso la superficie (diffusione e convezione determinate dalle
  condizioni idrodinamiche);
• Adesione alla superficie;
• Rilassamento delle molecole adsorbite (cambiamenti conformazionali e
  ottimizzazione dei contatti proteina-superficie)
  Difusion
  Adsorption and dehydration
  O
  Water
  Protein
  Denaturation

Fattori che Regolano l'Adsorbimento

1. Proprietà delle proteine
2. Proprietà delle superfici solide
3. Parametri esterni
   fattori
   sopra
   menzionati
   sono
   strettamente correlati, ovvero ciascuno di
   essi ha molteplici effetti sull'adsorbimento
   delle proteine.
   I
   Sia gli aspetti termodinamici che quelli
   cinetici
   dell'adsorbimento
   vengono
   influenzati da tali parametri.
   hydrophobic domains
   +
   +
   +
   +
   **
   ionic domains
   +
   +
   polar domains
   +
   +
   surface
   protein
   +

Proprietà delle Proteine

• Carica e distribuzione della carica;
• Struttura 3D in soluzione e stabilità conformazionale;
• Posizionamento e natura dei domini idrofobici;
• Acqua legata;
• Legame di specie a basso peso molecolare;
• Impurità.

Classificazione delle Proteine rispetto al Comportamento all'Interfaccia

Una classificazione delle proteine rispetto al loro comportamento
all'interfaccia può essere ottenuta considerando proprietà come:
STABILITÀ STRUTTURALE
DIMENSIONE
COMPOSIZIONE

• Proteine "HARD": proteine piccole e rigide (ad esempio ß-lattoglobulina)
  che mostrano poca tendenza ad alterazioni strutturali durante
  l'adsorbimento. Adsorbono essenzialmente su superfici idrofobiche.
• Proteine "SOFT": proteine di dimensioni intermedie e grandi che
  subiscono riarrangiamenti conformazionali
  dopo
  l'adsorbimento.
  Adsorbono su un'ampia varietà di superfici (idrofile/idrofobiche).

Lipoproteine e Glicoproteine

Le proteine SOFT includono lipoproteine e glicoproteine:

• Le lipoproteine mostrano una forte affinità con le superfici
  idrofobiche;
• Le glicoproteine vengono adsorbite ampiamente sulle
  superfici idrofile.
  Le proteine soft tendono ad adsorbirsi anche in condizioni
  elettrostatiche avverse.
  La maggior parte delle proteine del plasma sono SOFT.

Dimensioni delle Proteine e Adsorbimento

• Le proteine piccole si diffondono più velocemente di quelle
  grandi e, nelle miscele proteiche, sono le specie dominanti
  nella fase iniziale di adsorbimento.
• Le proteine di grandi dimensioni in genere si legano in
  modo più forte alla superficie grazie ad un'area di contatto più
  ampia e possono persino respingere altre proteine pre-
  adsorbite.

Proprietà delle Superfici Solide

• Composizione chimica, gruppi funzionali
• Morfologia e topografia della superficie
• Tipo e densità delle cariche superficiali
• Idrofilicità/idrofobicità
• Energia libera superficiale
• Stabilità in acqua e legame con acqua

Adesione delle Proteine ai Substrati

In generale, le proteine tendono ad aderire più fortemente ai
substrati che sono:

• non polari piuttosto che polari;
• alta tensione superficiale anziché bassa tensione superficiale;
• carichi anziché non carichi.
  Nella maggior parte dei casi, l'affinità delle proteine con le
  superfici aumenta su substrati idrofobici e diminuisce su
  substrati idrofili. Fanno eccezione le glicoproteine.

Parametri Esterni

• Temperatura
• pH
• Forza ionica (i.e. concentrazione ioni disciolti)
• Composizione del Buffer (e.g. sali)
  TABLE 3
  Protein and Solution Variables Important in the Study of Protein Adsorption
  Protein
  Solution
  Isoelectric point
  Net charge and charge distribution
  3-D structure in solution
  pH
  Ionic strength, ionic components, and buffer
  type
  Low MW species: amino acids, fatty acids,
  etc.
  Placement and nature of hydrophobic patches
  Charge-transfer groups or regions
  Bound water
  Protein type and concentration
  Temperature /pressure
  Hydrodynamics (flow)
  Dimer content-other "impurities"
  Binding of low MW species
  Rigidity/shape-conformational
  variability
  and dynamics
  Effect of labeling on all of the above

Effetto della Temperatura e del pH

• La temperatura ha un effetto sia sullo stato di equilibrio che sulla
  cinetica di adsorbimento. L'aumento della temperatura porta ad un
  aumento della velocità di adsorbimento e ad un aumento della quantità
  di proteine adsorbite.
• Il pH determina lo stato elettrostatico delle proteine.
  Le proteine sono molecole anfotere, cioè possono comportarsi sia come
  acidi che come basi a seconda dell'ambiente in cui si trovano. Questo
  comportamento dipende dai gruppi funzionali ionizzabili presenti sulla loro
  superficie.

Gruppi Funzionali Ionizzabili

Principalmente:

• Gruppi carbossilici (-COOH)
  sulle catene laterali di amminoacidi come
  acido aspartico e glutammico, che possono perdere un protone
  diventando negativamente carichi (-COO-)
• Gruppi amminici (-NH2) sulle catene laterali di amminoacidi come lisina,
  arginina e istidina, che possono accettare un protone diventando
  positivamente carichi (-NH3+)
  Ogni gruppo funzionale ionizzabile ha una propria costante di dissociazione
  acida (pKa) che determina a quale pH avviene la ionizzazione. Quando il
  pH è inferiore al pKa di un gruppo, quel gruppo tende ad essere protonato;
  quando il pH è superiore al pKa, tende ad essere deprotonato.

Punto Isoelettrico e Carica della Proteina

Il punto isoelettrico (pI) di una proteina è definito come il valore di pH al
quale la carica netta della proteina è zero. A questo specifico pH, il numero
di cariche positive bilancia esattamente il numero di cariche negative sulla
proteina. Il pI è una caratteristica intrinseca di ogni proteina e dipende dalla
sua composizione amminoacidica specifica.
Come il pH influenza la carica di una proteina rispetto al suo punto
isoelettrico?

Influenza del pH sulla Carica Proteica

pH < pI: In condizioni acide, i gruppi carbossilici tendono a rimanere
protonati (-COOH) e quindi neutri, mentre i gruppi amminici acquisiscono
protoni (-NH3+) diventando positivamente carichi. Il risultato è che la
proteina assume una carica netta positiva.
pH = pI: Al punto isoelettrico, le cariche positive e negative si bilanciano
perfettamente, rendendo la carica netta della proteina zero. A questo pH,
la proteina mostra la minima solubilità in acqua e tende a precipitare, poiché
le forze di repulsione elettrostatica tra molecole proteiche sono minimizzate.
pH > pl: In condizioni basiche, i gruppi carbossilici perdono protoni (-COO-)
diventando negativamente carichi, mentre i gruppi amminici tendono a
rimanere deprotonati (-NH2) e quindi neutri. Il risultato è che la proteina
assume una carica netta negativa.