Lesione cerebrale, stimolazione stereotassica e disturbi del sonno

Lesioni Cerebrali e Comportamento

Questa selettività permette al ricercatore di determinare se gli effetti comportamentali del danneggiamento di una particolare struttura cerebrale sono causati dalla morte dei neuroni ivi localizzati o dalla distruzione degli assoni che passano nelle vicinanze. Bisogna notare che, quando si producono lesioni sottocorticali passando radiofrequenze attraverso un elettrodo o somministrando una neurotossina con una cannula, si causa sempre un danno cerebrale addizionale: il passaggio dell'elettrodo o della cannula fino a raggiungere la zona di interesse produce inevitabilmente un piccolo danno, anche prima di accendere il dispositivo di lesione o di cominciare l'infusione. Perciò, non è possibile limitarsi semplicemente al confronto del comportamento degli animali cerebrolesi con quelli sani, utilizzati come gruppo di controllo; il il danno incidentale delle regioni cerebrali situate sopra il sito di lesione può in realtà spiegare alcuni dei deficit comportamentali osservati. Per ovviare il problema, è possibile operare un ulteriore gruppo di animali e produrre lesioni simulate: la procedura consiste nell'anestetizzare ciascun animale, inserire l'elettrodo o la cannula e spingerli nella profondità adeguata. Si duplicano tutti i passaggi necessari a produrre la lesione, eccetto accendere il dispositivo di radiofrequenza o iniziare l'infusione. Se il comportamento degli animali cerebrolesi risulta diverso da quello dei controlli con lesione simulata, si può dedurre che il danno comportamentale è stato causato proprio dalla lesione sperimentale.

Lesioni Temporanee

Nella maggior parte dei casi, i ricercatori producono lesioni cerebrali permanenti; talvolta, però, può essere vantaggioso alterare solo temporaneamente l'attività di una particolare regione cerebrale. Il modo più facile consiste nell'iniezione di anestetico locale o di un farmaco detto muscimolo nell'area di interesse. L'anestetico blocca i potenziali d'azione degli assoni che entrano o lasciano quella regione, producendo di conseguenza un'effettiva lesione temporanea. Il muscimolo, un farmaco che stimola i recettori GABA, inattiva la regione del cervello inibendo i neuroni ivi localizzati.

Chirurgia Stereotassica

CHIRURGIA STEREOTASSICA La stereotassi indica la capacità di localizzare gli oggetti nello spazio. L'apparato stereotassico è costituito da un fermatesta, che fissa in posizione standard il cranio dell'animale, e un reggielettrodo, che sposta l'elettrodo e la cannula nelle tre dimensioni spaziali, secondo distanze misurate. Per eseguire un simile intervento è necessario studiare prima un atlante stereotassico: è un libro, un sito web o un software che contiene immagini che corrispondono alle sezioni frontali del cervello effettuate a varie distante mostrali e caudali rispetto al bregma. Il cranio è costituito da diverse ossa, che crescono insieme e formano suture (giunture). La testa dei neonati contiene un punto molle a livelle dell'intersezione tra la satura sagittale e quella coronale, chiamato fontanella. Quando l'intervallo tra le suture si richiude, il punto d'intersezione è denominato bregma, dal termine greco che significa "porzione frontale della testa". Ogni immagine dell'atlante stereotassico è contrassegnata in base alla distanza della sezione anteriormente o posteriormente al bregma. La griglia di ciascuna immagina indica le distanze delle strutture cerebrali ventrali rispetto alla sommità del cranio e laterali rispetto alla linea mediana. € 0 -- D E . 27 F 21 F G I - 9 dc baa b c d A B C 22 O G H IL'APPARATO STEREOTASSICO L'apparato stereotassico include un fermatesta, che mantiene il cranio dell'animale nella posizione adeguata, un reggielettrodo o reggicannula, e un meccanismo calibrato che muove il reggielettrodo/reggicannula secondo distanze misurate lungo i tre assi: anteriore-posteriore, dorsale-ventrale e laterale-mediale. Una volta trovate le coordinate su un atlante stereotassico, si anestetizza l'animale, si posiziona l'apparato e si incide lo scalpo. Dopo la localizzazione del bregma, si riportano i numeri appropriati sull'apparato stereotassico, si perfora il cranio con il trapano e si inserisce il reggielettrodo nel cervello alla corretta profondità. In questo modo, la punta dell'elettrodo o della cannula è portata esattamente nell'area desiderata e si può procedere con la lesione. Esistono anche apparati stereotassici da utilizzare sull'uomo. Talvolta i neurochirurghi producono lesioni sottocorticali: ad esempio, per ridurre i sintomi della malattia di Parkinson. O O

Stimolazione Cerebrale Profonda

La stimolazione cerebrale profonda è un'altra procedura che richiede l'uso dell'apparato stereotassico. Si utilizza per trattare condizioni che includono dolore cronico, disturbi del movimento, epilessia, depressione e disturbo ossessivo-complusivo. La stimolazione cerebrale profonda utilizza un apparato stereotassico per impiantare a permanenza un elettrodo nel cervello dei pazienti. Piuttosto che produrre una lesione, la corrente elettrica che passa attraverso l'elettrodo serve a stimolare specifiche regioni del cervelli e ridurre i sintomi.

Metodi Istologici

METODI ISTOLOGICI Dopo la produzione di una lesione cerebrale su un modello animale e l'osservazione dei suoi effetti comportamentali, è necessario sezionare e colorare il tessuto cerebrale, in modo da esaminarlo al microscopio e verificare l'effettiva localizzazione della lesione. Gli istologi devono fissare, sezionare, colorare ed esaminare il cervello. Prese insieme, queste procedure sono definite "metodi istologici" (il prefisso isto- si riferisce ai tessuti corporei).

• Per studiare il tessuto, dobbiamo proteggerlo dagli enzimi autolitici ("autodistruggenti"), che altrimenti trasformano il tessuto in poltiglia e ne rendono impossibile lo studio. È necessario, inoltre, prevenire la decomposizione tessutale da parte di batteri e muffe. Entrambi questi obiettivi possono essere raggiunti immergendo il tessuto nervoso in un bagno fissatore. Il fissatore più comunemente utilizzato è la formalina o paraformaldeide, la soluzione acquosa del gas formaldeide.
• Prima della fissazione, il tessuto cerebrale viene generalmente sottoposto a perfusione. La perfusione tessutale consiste nella rimozione del sangue, che è sostituito con un altro liquido. Il tessuto cerebrale dell'animale è sottoposto a perfusione perché, in assenza di sangue, si ottengono risultati istologici migliori. Si incidono i vasi sanguigni per drenare il sangue, sostituendolo con soluzione fisiologica. Quindi, si pompa nel tessuto una soluzione diluita di fissatore, si rimuove il cervello dal cranio e si posiziona in un contenitore pieno di fissatore.
• Dopo aver fissato il cervello, è necessario sezionarlo finemente e colorare le vari strutture cellulari, per evidenziare i dettagli anatomici. La procedura di sezione si effettua con un microtomo o un criostato. Il microtomo è costituito da tre parti: un bisturi, una piattaforma su cui montare il tessuto e un meccanismo che avanza il bisturi di uno spazio fisso dopo il taglio diciascuna fetta, prima di procedere con la sezione successiva. Dopo la sezione, il tessuto è montato su vetrini e può essere colorato, immergendo l'intero vetrino in varie soluzioni chimiche.
• L'esame microscopico di una sezione di tessuto cerebrale non colorata permette di vedere i contorni di alcune grosse masse cellulari e i fasci di fibre più prominenti. Lo studio della neuroanatomia microscopica richiede l'utilizzazione di speciali coloranti istologici: il blu di metilene e il cresi violetto sono due esempi di sostanza che colorano i corpi cellulari del tessuto cerebrale.

Microscopia

Quando il tessuto è stato fissato, sezionato, colorato, montato su vetrino e bloccato sotto un coprivetrino, i ricercatori possono esaminarlo utilizzando un microscopio ottico. Sono meno costosi degli altri tipi di microscopio e possono essere utilizzati per un'ampia varietà di ricerche che richiedono la visione delle cellule sotto ingrandimento. Molti ricercatori utilizzando il microscopio ottico per esaminare il tessuto colorato, benché la sua capacità di rilevare dettagli estremamente piccoli sia piuttosto limitata. Per visualizzare strutture anatomiche molto piccole, come vescicole sinaptiche e dettagli del organelli cellulari, è necessario utilizzare un microscopio elettrico a trasmissione. Il microscopio elettrico a scansione permette un minore ingrandimento rispetto allo standard a trasmissione di elettroni, che fa passare il fascio elettronico attraverso il tessuto. Il microscopio convenzionale e quello elettronico richiedono la preparazione del tessuto in sezioni sottili. L'avvento del microscopio confocale a scansione laser ha reso possibile osservare i dettagli all'interno di sezione tessutali spesse o persino in pezzi di tessuto mantenuti in apposite colture, o negli strati superiori del cervello vivente esposto.

Tracciamento Connessioni Neurali

TRACCIAMENTO DELLE CONNESSIONI NEURALI Supponiamo di essere interessati a scoprire i meccanismi neurali responsabili del comportamento riproduttivo. Per iniziare, vogliamo studiare la fisiologia del comportamento sessuale della femmina di ratto. Produciamo una lesione del nucleo ventromediale dell'ipotalamo (IVM) negli animali del gruppo sperimentale, mentre ci limitiamo ad una lesione simulata in quelli del gruppo di controllo. Dopo qualche giorno di convalescenza, posizioniamo ciascun animale in una gabbia con ratti maschi, scegliendo un giorno recettivo del ciclo dell'estro. Le femmine del gruppo di controllo rispondono positivamente alle attenzioni maschili, al contrario, le femmine con lesione all'IVM rifiutano le attenzioni maschili e l'accoppiamento. Successivamente, l'esame istologico conferma l'effettiva distruzione dell'IVM nel cervello degli animali sperimentali. I risultati del nostro esperimento indicano che i neuroni dell'IVM sembrano giocare un ruolo nelle funzioni necessarie al comportamento compilatorio dei ratti femmina. Una questione riguarda il sistema delle strutture cerebrali che partecipano al comportamento copulatorio femminile: certamente, l'IVM non funziona da solo; riceve e trasmette impulsi ad altre strutture. La copulazione richiede l'integrazione di percezioni visive, tattili e olfattive e l'organizzazione di modelli di movimento in risposta a quelli del partner. In anni recenti i ricercatori hanno sviluppato metodi molto precisi per evidenziare alcuni neuroni specifici, differenziandogli dagli altri. È chiaro che l'IVM influenza il comportamento. Ciò significa che i neuroni dell'IVM necessariamente inviano assoni a parti del cervello che contengono neuroni responsabili dei movimenti muscolari. Dobbiamo essere in grado di identificare le vie seguite dagli assoni che lasciano l'IVM. A questo fine, utilizzeremo un metodo di marcatura anterograda: i metodi di marcature anterograda impiegano sostanza chimiche che sono assorbite dai dendriti o dai corpi cellulari e quindi trasportate attraverso gli assoni, verso i bottoni terminali. Per scoprire la destinazione degli assoni efferenti dei neuroni localizzati nell'IVM potremmo iniettare una piccola quantità di PHA-L (una proteina del fagiolo) nel nucleo, utilizzando un apparato stereotassico. Le molecole di PHA-L sono assorbite dai dendriti e trasportate dal soma all'assone, dove viaggiano fino ai bottoni terminali grazie al trasporto assoplasmatico rapido.