Sperimentazione pre-clinica: fasi, tossicità e studi di genotossicità

Sperimentazione Pre-Clinica

Studi di Fase I

Ludovica Diliberto SPERIMENTAZIONE PRE-CLINICA Studi di fase I della sperimentazione pre-clinica servono per:

• valutare le caratteristiche farmacodinamiche in particolare l'effetto principale, gli effetti collaterali e la durata dell'effetto farmacologico
• valutare la tossicità acuta
• valutare la stabilità chimica

Questa sperimentazione viene effettuata tramite due vie di somministrazione:

1. una simile a quella che verrà proposta nell'uomo
2. l'altra per garantire un assorbimento sistemico

La durata della sperimentazione deve mettere in risalto gli eventuali danni ai tessuti o organi può essere effettuata in 14 giorni, mai inferiore ai 7 giorni.

Studi di Fase II

Negli studi di fase II:

• si valutano i parametri farmacocinetici
• si valuta la tossicità subacuta e cronica come per esempio le prove di mutagenesi
• si valuta la tecnica farmaceutica come formulazioni e dosaggio

Con gli studi di tossicità subacuta e cronica si mette in evidenza:

• alterazioni funzionali e anatomiche
• effetti teratogeni
• effetti sulla fertilità
• effetti sul periodo peri e post-natale
• prove di mutagenesi e cancerogenesi

In generale le prove di tossicità acuta e cronica devono mettere in evidenza le alterazioni funzionali e/o anatomiche e stabilire le condizioni della comparsa di tali alterazioni in funzione della dose. La valutazione degli effetti tossici viene effettuata in base a prove funzionali a carico di diversi organi come cuore, fegato, rene e milza.

Tossicità Subacuta

TOSSICITA' SUBACUTA La sperimentazione viene effettuata somministrando tre dosi a gruppi diversi di animali in modo random e utilizzando due specie di mammiferi, la durata è di 30-90 giorni. I gruppi sperimentali sono tre e le dosi somministrate sono diverse e poi a questi viene aggiunto un quarto gruppo che è quello di controllo.Nella tossicità subacuta:

• dose più elevata viene scelta in modo da far comparire effetti tossici d'organo o mortalità
• dose minore permette di fissare il margine di tolleranza del prodotto nell'animale e va scelta in base alle capacità di ottenere l'effetto farmacologico
• dose immediata è la media geometrica della dose maggiore e minore.

Tossicità Cronica

TOSSICITA' CRONICA (durata 3-12 mesi) Le dosi vengono stabilite in modo che: dose maggiore: deve dare segni di tossicità dose minore: sia ben tollerata, sia da 2 a 10 volte superiore a quella giornaliera prevista per l'uso terapeutico in clinica umana. dose intermedia: minima dose capace di dare il primo effetto tossico

Esame della Funzione Riproduttiva

ESAME DELLA FUNZIONE RIPRODUTTIVA Su due specie animali si valutano probabili modifiche a carico della riproduttività come modifiche della fertilità o procreazione anormale, interferenza con le fasi di preimpianto e impianto del feto e sul suo sviluppo, effetti sulla crescita o sviluppo dell'utero o della placenta, interferenza con il parto, ma anche effetti sullo sviluppo postnatale, allattamento ed effetti tardivi sulla discendenza. In particolare deve vedere gli effetti tossici sul feto ed embrione.

Studi di Cancerogenicità

STUDI DI CANCEROGENICITA' In questi studi si osserva:

• incidenza dei tumori
• i tessuti interessati
• periodo di latenza prima della loro manifestazione

Vengono utilizzate due specie animali, quella preferita è il roditore, i gruppi sperimentali devono essere di almeno 100 animali uno per ogni livello di dose e la somministrazione giornaliera del farmaco per la stessa via proposta per l'uomo documentando l'assorbimento del farmaco. Le prove per gli studi di cancerogenicità (durata dai 18 ai 24 mesi) vanno effettuate almeno a tre dosaggi: dose massima: vi è almeno un minimo effetto tossico oppure una tossicità minima a livello di organo bersaglio dose minima: pari al doppio o al triplo della dose terapeutica massima per l'uomo o della dose che produce un effetto farmacologico nell'animale dose intermedia: è la media geometrica fra la massima e la minima. Alcuni sintomi di tossicità posso essere osservati solo in vivo e contrariamente non è possibile notarli in vitro come ad esempio: il tremore, l'eccitazione, sedazione, amnesia, ipertermia, ototossicità, neurotossicità, ipovisione, ipotensione, calcoli renali, ulcera gastrica fragilità ossea, infiammazione acuta e cronica.Nelle prove farmacologiche si valuta l'azione a diversi livelli:

• sul SNC (interferenza sulla temperatura corporea, attività locomotoria e di coordinazione motoria)
• sul SNP e sui muscoli scheletrici (giunzioni neuromuscolare, muscolo gastrocnemio)
• sul SNA e muscolature lisce (ileo isolato, vasi deferenti isolati, trachea isolata, secrezione salivare)
• sul tratto gastro-intestinale (motilità intestinale, secrezione gastrica, potere ulcerato, secrezione biliare, stomaco isolato, prove biochimiche sulla funzionalità epatica)
• sul sangue (emolisi in vitro e coagulazione)
• sul rene (analisi delle urine)
• sul sistema cardiovascolare (pressione arteriosa, frequenza respiratoria, aorta isolata, cuore isolato)
• sistema riproduttivo (utero isolato, motilità uterina in situ).

Valutazione della Tollerabilità Locale

VALUTAZIONE DELLA TOLLERABILITA' LOCALE DELLA VIA DI SOMMINISTRAZIONE Descrizione conclusiva della sperimentazione preclinica La relazione finale include:

1. INFORMAZIONI GENERALI: -data di inizio e fine sperimentazione -indirizzo del centro ricerche e laboratorio in cui è stato condotto lo studio -firma del responsabile della sperimentazione
2. PROGRAMMA SPERIMENTALE: -scopo della ricerca - sistema di dosaggio usato, come animali (specie, provenienza, sesso) o cellule e la giustificazione della scelta della via di somministrazione per il trattamento - denominazione e numero di lotto - certificato di analisi del prodotto in esame e dei prodotti di confronto - descrizione delle fasi sperimentali con indicazioni dei metodi e osservazioni effettuate ed eventuali metodi statistici usati
3. RISULTATI E CONCLUSIONI

Prodotti in Esame e Reagenti

PRODOTTI IN ESAME E REAGENTI I prodotti in esame devono essere identificati mediante: -nome e sigla-lotto -condizioni di conservazione -data di scadenza Tutta la documentazione va conservata per 10 anni

Studi di Tossicità Sperimentali

Studi Tossicologici sulla Riproduzione e Sviluppo

STUDI DI TOSSICITA' SPERIMENTALI Studi tossicologici sulla riproduzione e sviluppo Gli obiettivi sono quelli di valutare l'effetto tossico dello xenobiotico sulle varie fasi della riproduzione e sviluppo. In particolare:

• evidenziare le eventuali modifiche di fertilità o procreazione anomala dovuta a danni dei gameti maschili e/o femminili
• interferenze con le fasi di impianto del feto e del suo sviluppo
• effetti tossici sull'embrione
• effetti tossici sul feto
• interferenze con il parto
• effetti sullo sviluppo postnatale
• effetti tardivi sulla discendenza

ANIMALI USATI: sono 2 specie animali MODALITA': somministrazione del composto a maschi e femmine prima dell'accoppiamento, durante la gravidanza e l'allattamento. Viene seguito lo sviluppo dei nuovi nati fino al loro nuovo accoppiamento per giungere ad una successiva generazione.

Guida Internazionale per l'Armonizzazione (ICH)

Guida internazionali per l'armonizzazione (ICH) Nasce nel 1990 e ha come obiettivo quello di armonizzare l'interpretazione e l'applicazione delle linee guida tecniche nella valutazione dei medicamenti a uso umano Gaia Gianì

Studi Tossicologici sulla Riproduzione

STUDI TOSSICOLOGICI SULLA RIPRODUZIONE: lo scopo di questi studi è quello di rivelare gli effetti di una sostanza sulla riproduzione dei mammiferi. Specie: roditore (per es. ratto) e non-roditore (per es. coniglio solo negli studi di embriotossicità) Gruppi: controllo + 3 livelli di dose Via di somministrazione: generalmente quella clinica Frequenza: generalmente giornaliera Disegni di studio generalmente proposti:

• Fertilità e sviluppo embrionale precoce fino all'impianto
• Sviluppo pre- e postnatale
• Sviluppo embrio-fetale
• Combinazione dei precedentiLe osservazioni sullo sviluppo pre- e postnatale possono avvenire:

Durante lo studio (madri): Mortalità e segni clinici

• Peso corporeo
• Consumo cibo
• Durata della gravidanza
• Parto

A termine :- Necroscopia (osservazioni macroscopiche degli adulti) - Ritenzione delle anormalità (istopatologia se necessario) - Numero di cuccioli vivi o morti alla nascita

• Peso corporeo alla nascita
• Sopravvivenza pre e post-svezzamento, crescita ponderale, maturazione e fertilità
• Sviluppo fisico
• ⁃
• ⁃

Studi Tossicologici di Cancerogenicità

STUDI TOSSICOLOGICI DI CANCEROGENICITÀ: l'obiettivo di questi studi è identificare la capacità di indurre tumori nell'animale e il possibile rischio per l'uomo. Non solo, questi studi hanno anche lo scopo di registrare l'incidenza dei tumori (soprattutto quelli che colpiscono determinati tessuti) e di registrare il periodo di latenza prima della loro manifestazione. Sono richieste per nuove molecole ma particolarmente, per quelle appartenenti a determinate categorie:

• molecole di una classe chimica che ha già dimostrato effetti cancerogeni rilevanti anche per l'uomo;
• relazione struttura attività che suggerisce un rischio cancerogeno;
• evidenza di lesioni neoplastiche negli studi di tossicità ripetuta;
• ritenzione a lungo termine della molecola o suoi metaboliti, in determinati organi;
• evidenze di positività nei test di mutagenesi.

Durata degli studi: dai 18 mesi (per il topo) ai 24 mesi (per il ratto) Animali utilizzati: due specie animali somministrando il farmaco per la stessa via proposta per l'uomo. gruppi sperimentali di almeno 100 animali per livello di dose e gruppo di controllo

• (sacrificio di animali ai diversi end points) oppure studi con microPET con esiguo numero di Scelta delle dosi:

• La dose massima deve esercitare un minimo effetto tossico (riduzione del peso corporeo del 10% = dose massima tollerata = MTD) oppure una tossicità minima a livello di un organo bersaglio.
• La dose minima deve produrre un effetto farmacologico ma non tossico nell'animale.
• La dose intermedia è la media tra la massima e la minima Osservazioni: segni clinici, masse, peso corporeo, consumo cibo, ematologia, chimica clinica, analisi urine, oftalmoscopia Osservazioni post-mortem: necroscopia, peso degli organi, analisi istologica di tutti i tessuti e masse

Studi Tossicologici di Genotossicità/Mutagenesi

STUDI TOSSICOLOGICI DI GENOTOSSICITÀ/MUTAGENESI: studiano gli effetti indotti dall'impatto di un composto nuovo sul patrimonio genetico attraverso:

• Saggio di mutazione genica in batteri
• Saggio di genotossicità in vitro in cellule di mammifero
• Un test in vivo per la valutazione del danno cromosomico usando cellule ematopoietiche di roditori

Con il test di Ames si evidenziano mutazioni puntiformi in procarioti (ceppi di Salmonella Thyphimurium e di Escherichia coli). Con il test di aberrazioni cromosomiche su linfociti umani si valuta l'effetto clastogeno (addizione, riarrangiamento di cromosomi) della molecola in studio sui cromosomi. Test dei micronuclei Con il test del mouse lymphoma (preferito in USA) ha due end points: valutazione dell'induzione di mutazioni geniche + effetto clastogeno (= mutazioni più estese o rotture del DNA). Una sostanza mutagena è potenzialmente responsabile dell'induzione di cancerogenesi e/o di malformazioni fetali. L'obiettivo principale della tossicologia non è determinare la dose che non causa effetti dannosi per gli animali da laboratorio ma conoscere i livelli di sicurezza per l'uomo.

Definizioni

DEFINIZIONI:

• LD50 (Lethal Dose, dose letale mediana): Rappresenta la dose di una sostanza chimica che determina la morte del 50% degli individui in saggi di tossicità acuta per somministrazione diretta (orale o intraperitoneale). Viene di norma espressa in termini ponderali per unità di peso corporeo dell'individuo (mg/kg). In modo analogo si esprimono dosi riferite a diverse percentuali di mortalità (LD10, LD90). LC50 (Lethal Concentration 50, concentrazione letale mediana). Rappresenta la concentrazione di una sostanza che determina la morte del 50% degli individui in saggi di tossicità acuta per esposizione ambientale (ad esempio tossicità acquatica o inalatoria). Si deve riferire al tempo di esposizione (es LC50 48 ore). EC50 (Effettive Concentration 50, concentrazione efficace mediana): Rappresenta la concentrazione che produce nel 50% degli individui un effetto diverso dalla morte (immobilizzazione, arresto della crescita, ecc) in saggi sia acuti che cronici. Deve essere anch'essa riferita al tempo di esposizione.

# LT50 (Lethal Time, tempo letale mediano): Rappresenta il tempo necessario a determinare la morte del 50% degli individui esposti ad una concentrazione determinata di una sostanza. NOEL (No Observed Effects Level): Rappresenta il più alto livello (concentrazione o dose) al quale non si manifesta alcun effetto. Può anche essere riferito a saggi di tossicità acuta ma, di norma, si riferisce a saggi cronici a lungo termine.