Biotecnologie: clonaggio genico, PCR e sequenziamento del DNA

Il clonaggio genico

Il clonaggio genico è una tecnica che permette di:

• Copiare un gene (un pezzo di DNA che contiene le istruzioni per costruire una proteina)
• Inserirlo in un batterio
• Far produrre al batterio tante copie di quella proteina

Per fare tutto questo, servono strumenti molecolari:

1. Enzimi di restrizione = come forbici molecolari che tagliano il DNA in punti precisi.
2. DNA ligasi = come colla molecolare che attacca insieme i pezzi di DNA.
3. Plasmide = un piccolo anello di DNA che funziona come navetta per portare il gene dentro il batterio.

Un plasmide è un piccolo cerchio di DNA che si trova nei batteri. Può essere modificato per trasportare un gene di nostro interesse. Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere:

• Origine di replicazione -> così può duplicarsi dentro il batterio.
• Geni marcatori -> ci aiutano a vedere se il batterio ha preso il plasmide (es. resistenza ad antibiotici).
• Siti di restrizione unici -> punti precisi dove possiamo inserire il gene che vogliamo clonare.
• Polylinker (MCS) -> un'area con tanti siti di taglio diversi, per scegliere dove inserire il gene.

Processo di clonaggio genico

❖ COME FUNZIONA IL PROCESSO

1. Preparazione del DNA

• Si taglia il gene da inserire (con gli enzimi di restrizione).
• Si apre il plasmide nello stesso punto.
• Si incolla il gene dentro il plasmide usando la DNA ligasi -> si ottiene plasmide ricombinante.

1. Trasformazione

• Si mescola il plasmide ricombinante con batteri resi competenti (cioè pronti a prendere DNA).
• Alcuni batteri assorbono il plasmide -> ora sono batteri geneticamente modificati.

1. Selezione dei batteri giusti

• Si mette tutto su una piastra con antibiotico.
• Solo i batteri con il plasmide sopravvivono (perché hanno il gene di resistenza).
• Gli altri muoiono.
• Ma attenzione: non tutti i batteri sopravvissuti hanno davvero il gene che ci interessa.

1. Selezione più precisa

• Si usa il gene lacZ: se è integro, fa diventare blu le colonie (funziona ancora).
• Se è interrotto (perché dentro c'è il nostro gene), la colonia resta bianca. Quindi: colonie bianche = batteri con il gene inserito correttamente

Applicazioni del clonaggio genico

Con questo metodo possiamo:

• Far produrre insulina ai batteri (usata dai diabetici)
• Far produrre enzimi industriali
• Produrre ormoni, vitamine, vaccini
• Fare ricerca genetica (studiare le funzioni dei geni)

Produzione di farmaci come l'insulina

Produzione di farmaci come l'insulina

• Si prende il gene umano che produce insulina.
• Lo si inserisce in un vettore di espressione.
• Si trasforma un batterio (E. coli).
• Il batterio, leggendo quel gene, produce insulina umana.Questo processo ha permesso di produrre molti farmaci come: somatostatina,
• insulina,
• interferoni,
• interleuchine, ecc.

Vettori per clonaggio di DNA

❖ Perché servono vettori "capienti" (cioè che possono contenere molto DNA)? I plasmidi sono comodi da usare nei laboratori, ma possono trasportare solo piccoli frammenti di DNA (fino a 15.000 nucleotidi). Per trasportare frammenti più grandi (per esempio quando vogliamo clonare tutto il DNA di un organismo), servono vettori alternativi più "grandi", come:

Fagi (virus batterici)

• Usano sequenze speciali chiamate "cos" per impacchettare il DNA nel capside virale.
• Possono trasportare tra 8.000 e 20.000 nucleotidi.
• Sono più capienti dei plasmidi, ma più complicati da usare.

BAC (Bacterial Artificial Chromosome - Cromosoma artificiale batterico)

• Deriva da un plasmide naturale dei batteri chiamato fattore F.
• Contiene tutto il necessario per replicarsi dentro il batterio.
• Può trasportare frammenti molto grandi di DNA (fino a 300.000 paia di basi).
• Ottimo per costruire librerie genomiche.

YAC (Yeast Artificial Chromosome - Cromosoma artificiale di lievito)

• I vettori più capienti in assoluto.
• Sono simili ai cromosomi veri e propri: hanno telomeri, centromero e origini di replicazione.
• Possono contenere milioni di paia di basi.
• Usati per grandi progetti genomici (es. genoma umano).

Cosmidi

• Sono plasmidi modificati: hanno le sequenze "cos" dei fagi.
• Possono contenere tra 32.000 e 50.000 paia di basi.
• Uniscono la semplicità dei plasmidi alla capacità dei fagi.

Libreria genomica (o genoteca)

❖ Cos'è una libreria genomica (o genoteca)? È una collezione completa di frammenti di DNA di un organismo, ognuno clonato in un vettore. Serve per studiare o conservare l'intero patrimonio genetico di un organismo.

Per trovare un gene nella libreria si usa una tecnica chiamata ibridazione con sonde:

1. I batteri della libreria vengono fatti crescere su piastre -> ogni colonia ha un frammento diverso.
2. Si fa una copia delle colonie su un filtro (membrana).
3. Si usa una sonda di DNA (cioè una sequenza complementare al gene che cerchiamo).
4. La sonda è radioattiva o fluorescente.
5. Si lava il filtro -> resta solo la sonda che si è legata.
6. Si individua quale colonia contiene il gene cercato.

Libreria di cDNA

Cos'è una libreria di cDNA? È una libreria fatta non dal DNA totale, ma solo dai geni attivi in un certo momento.

Come si fa;

1. Si estrae mRNA da una cellula.
2. Si usa un enzima (trascrittasi inversa) per fare cDNA, cioè DNA complementare all'mRNA.
3. I cDNA vengono clonati in vettori -> si crea la libreria di cDNA.

Terapia genica

COS'È LA TERAPIA GENICA? La terapia genica è un tipo di trattamento medico che mira a curare malattie agendo direttamente sui geni. Invece di curare solo i sintomi, prova a risolvere la causa alla radice, cioè il DNA difettoso.

Si può fare in vari modi:

• sostituire un gene malato con uno sano;
• aggiungere un gene nuovo che aiuti a combattere la malattia;
• disattivare un gene difettoso, per impedirgli di fare danni;
• oppure modificare la proteina sbagliata che quel gene produce.

Per portare il gene dentro le cellule, si usano vettori, cioè strumenti molecolari che trasportano il DNA nella cellula bersaglio

I vettori devono essere:

• precisi, cioè riconoscere bene le cellule malate;
• sicuri, cioè non scatenare una reazione del sistema immunitario;
• stabili, cioè capaci di far funzionare il gene in modo controllato e duraturo.

Tipi di vettori per terapia genica

Tipi di vettori:

1. Vettori virali (i più usati): virus modificati che non causano malattia ma sono ottimi per "infilare" DNA nelle cellule.
2. Liposomi: piccole vescicole di grasso che possono contenere DNA e fondersi con la membrana cellulare.

Modalità di terapia genica

DUE MODI DI FARE TERAPIA GENICA

Terapia genica ex vivo (fuori dal corpo)

Terapia genica ex vivo (fuori dal corpo):

1. Si prelevano le cellule del paziente (es. dal sangue).
2. In laboratorio, si inserisce il gene sano.
3. Le cellule modificate vengono reinfuse nel paziente. È più sicura perché le cellule si controllano prima di rimetterle nel corpo.

Terapia genica in vivo (dentro il corpo)

Terapia genica in vivo (dentro il corpo): Si inietta direttamente il vettore con il gene terapeutico nel corpo del paziente. L'iniezione può essere locale (su un organo specifico) o sistemica (nel sangue). È più semplice ma anche più difficile da controllare, perché agisce direttamente dentro l'organismo.

Difficoltà della terapia genica

QUALI SONO LE DIFFICOLTÀ?

• È difficile raggiungere tutte le cellule malate, specialmente in tessuti grandi o profondi.
• Le cellule non vivono per sempre: quindi anche il gene corretto può "sparire" quando le cellule muoiono.
• Il gene inserito potrebbe non funzionare bene o essere attivo al momento sbagliato.
• Il sistema immunitario può attaccare il vettore o le cellule modificate.

Per superare questi problemi, i ricercatori lavorano su:

• modelli più efficienti di vettori
• tecniche per agire sulle cellule staminali, che possono rigenerare i tessuti a lungo termine

La terapia genica è ancora in fase sperimentale per molte malattie, ma ha già avuto dei risultati importanti.

Casi significativi di terapia genica

Ecco casi significativi:

ADA-SCID

• È una grave immunodeficienza genetica (il sistema immunitario non funziona).
• I pazienti possono essere curati con terapia genica ex vivo, inserendo il gene ADA corretto nelle cellule del sangue.

Distrofia muscolare di Duchenne

• Malattia ereditaria che colpisce i muscoli, rendendoli progressivamente più deboli.
• Sono in corso terapie sperimentali per riparare il gene difettoso che causa la malattia.

Leucodistrofia metacromatica

• Malattia rara che distrugge il sistema nervoso.
• Nel 2020 è stata approvata una terapia genica ex vivo in Europa.
• Realizzata dall'Istituto Telethon San Raffaele (Milano), questa terapia inserisce più copie sane del gene ARSA nelle cellule staminali ematopoietiche (cioè quelle che producono tutte le cellule del sangue).

Nuove frontiere: gli esosomi

NUOVE FRONTIERE: GLI ESOSOMI Gli scienziati stanno esplorando nuove tecnologie, tra cui l'uso degli esosomi. Sono minuscole vescicole di grasso prodotte naturalmente dalle cellule, che prima si pensava fossero solo "scarti".

Perché sono interessanti?

• Gli esosomi possono trasportare RNA o DNA da una cellula all'altra.
• Sono molto tollerati dall'organismo, non provocano infiammazione.
• Potrebbero diventare una valida alternativa ai virus come vettori.

Replicazione del DNA in provetta

Replicare il DNA in provetta Negli anni passati, l'unico modo per ottenere molte copie di un gene o frammento di DNA era il clonaggio genico (inserire il gene in un plasmide, metterlo in un batterio, farlo moltiplicare ... ). Questo metodo era lento e complesso.

Dagli anni '80, però, c'è stata una rivoluzione con l'arrivo della PCR, cioè la Polymerase Chain Reaction o "reazione a catena della polimerasi".

La PCR è una tecnica di laboratorio che permette di copiare rapidamente un frammento preciso di DNA in provetta. Con pochi ingredienti e in poche ore, si può ottenere una quantità enorme di copie, anche a partire da una quantità piccolissima di DNA iniziale.

Elementi fondamentali per la PCR

Per fare una PCR servono quattro elementi fondamentali:

1. DNA stampo = il DNA originale che contiene la sequenza che vogliamo copiare.
2. Primer = due brevi frammenti di DNA (circa 15-30 nucleotidi) che si attaccano ai lati opposti del pezzo da copiare e permettono alla polimerasi di iniziare la copia.

• Uno si chiama forward primer e l'altro reverse primer.

1. DNA polimerasi = un enzima che copia il DNA.
2. Nucleotidi trifosfato (dNTPs) = i "mattoni" per costruire il nuovo DNA.

Funzionamento della PCR (3 step ripetuti a ciclo)

COME FUNZIONA LA PCR? (I 3 STEP RIPETUTI A CICLO) La PCR è un processo ciclico: le stesse tre fasi si ripetono 20-30 volte, e ogni ciclo raddoppia il numero di copie.

Denaturazione

1. Denaturazione (circa 90-95 ℃) Il DNA viene scaldato ad alta temperatura per separare i due filamenti (che sono tenuti insieme da legami a idrogeno). Ora i due filamenti sono pronti per essere copiati.

Appaiamento dei primer o annealing

2. Appaiamento dei primer o annealing (circa 50 ℃) La temperatura si abbassa per permettere ai primer di legarsi (appaiarsi) alle estremità della sequenza da copiare. I primer sono specifici e si attaccano solo se trovano la sequenza giusta.

Estensione o sintesi

3. Estensione o sintesi (circa 72 ℃) La DNA polimerasi si lega ai primer e inizia a costruire i nuovi filamenti, usando i nucleotidi come "mattoni". Il risultato è che da 1 molecola iniziale se ne ottengono 2 identiche. Questo ciclo si ripete: alla fine del 2º ciclo ci sono 4 copie, poi 8, 16, 32 ... La crescita è esponenziale: in teoria, dopo n cicli si ottengono 2ª copie.