Talassemia e Anemia Falciforme: diagnostica molecolare, Università di Ferrara

Analisi Diagnostiche di Emoglobinopatie

• Le emoglobinopatie più comuni
• Analisi di primo livello (esame emocromocitometrico)
• Analisi di secondo livello (analisi dell'espressione globinica-analisi cromatografiche)
• Analisi di terzo livello (analisi genetica-sequenziamento DNA)

Emoglobina

Hemoglobin Molecule iron heme group ß chain CH2 CH3 CH2 H3C N H3C CH3 red blood cell OH O OH O ß chain -a chain a chain helical shape of the polypeptide molecule

Basi Molecolari: Geni Globinici ed Emoglobine

Cluster Beta-Globinico e Alfa-Globinico

Cluster beta-globinico Cromosoma 11 epsilon gamma delta beta 5' 3' Hb F Hb A2 Hb A Cluster alfa-globinico Cromosoma 16 Zeta 2 Zeta 1 Alfa 2 Alfa 1 5' 3'

Emoglobine Embrionali, Fetali e Adulte

Emoglobine embrionali : Hb Gower I ((282) Hb Portland (§2Y2) Hb Gower II (a2£2) Emoglobina fetale : Hb F (a2Y2) Emoglobine adulte : Hb A2 (a282) Hb A (a2B2)

Lo Switch Emoglobinico

Yolk sac Liver Spleen Bone marrow Globin synthesis (%) 100 Y 60 20 - δ 0 3 6 9 12 Infancy Months of gestational age ß-Globin locus 54321 3 Gy Ay 8 Chr11 LCR HSs Embryonic Fetal Adult 3'HS1 Sankaran & Orkin, Cold Spring Harb Perspect Med (2018)

Catene Alfa, Beta e Gamma

Catene a 50% Catene B Catene Y 25% 0% -9 Concepimento 0 Nascita 9 Mesi

HbA e HbF

Differenze e Affinità per l'Ossigeno

HbA: 2 catene alfa e 2 catene beta HbF: 2 catene alfa e 2 catene gamma Le catene gamma hanno maggior affinità per l'ossigeno, perché non legano il il 2,3-bisfosfoglicerato (BPG): l'istidina dell'HbA (carica positivamente) è sostituita da una serina nella HbF Il BPG si lega con la Deossiemoglobina in proporzione di 1:1, attaccando selettivamente la cavità centrale del tetramero, stabilizzandone la struttura, e diminuendone così l'affinità per l'ossigeno l'HbF ha la caratteristica di essere più affine per l'ossigeno per poterlo "catturare" dal sangue materno.

Modello Molecolare a Loop dello Switch

Fetal stage LCR 0 1 2345 3 CP2 CP2 NF-E4 NF-E4 KLF11 Gy KLF11 AV δ B a Adult stage LCR w FOP SOX6 1 2 345 a COUP- TFII DRED DNMT1 LDB1 LMO2 9XOS FOG GATA1 NURD DNMT1 COUP- TFII DRED AY BCL 11A δ KLF1 B Forcina di DNA tra la zona LCR (Locus Control Region) e i promotori, possibile grazie alla presenza di diversi fattori trascrizionali (TFs) durante le diverse fasi di sviluppo (fetale e adulta). Nella fase fetale, fattori di trascrizione facilitano l'attivazione della trascrizione di geni globinici avvicinando LCR, enhancers distali (1-5), ai 2 promotori (fig. sopra), mentre nella fase adulta, repressori legano i promotori, impedendo il legame coi fattori di attivazione (TFs) e permettendo a BCL11A e KLF1 di richiamare LCR sui promotori dei geni 8 e ß globinici (figura sotto). ST Diepstraten, Blood review, 2019 FOP BCL11A Gy

BCL11A: Repressione del Promotore e Switch Emoglobinico

Published in final edited form as: Cell. 2018 April 05; 173(2): 430-442.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.03.016. Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch Nan Liu1,", Victoria V. Hargreaves1,", Qian Zhu2,", Jesse V. Kurland3, Jiyoung Hong1, Woojin Kim1, Falak Sher1, Claudio Macias-Trevino1, Julia M. Rogers3,4, Ryo Kurita5, Yukio Nakamura5, Guo-Cheng Yuan2, Daniel E. Bauer1, Jian Xu6, Martha L. Bulyk3,4,7, and Stuart H. Orkin1,8 Abstract Fetal hemoglobin (HbF, a2Y2) level is genetically controlled and modifies severity of adult hemoglobin (HbA, a2ß2) disorders, sickle cell disease and ß-thalassemia. Common genetic variation affects expression of BCL11A, a regulator of HbF silencing. To uncover how BCL11A supports the developmental switch from y- to B- globin, we use a functional assay and protein binding microarray to establish a requirement for a zinc-finger cluster in BCL11A in repression, and identify a preferred DNA recognition sequence. This motif appears in embryonic and fetal- expressed globin promoters, and is duplicated in y-globin promoters. The more distal of the duplicated motifs is mutated in individuals with hereditary persistence of fetal hemoglobin. Using the CUT&RUN approach to map protein binding sites in erythroid cells, we demonstrate BCL11A occupancy preferentially at the distal motif, which can be disrupted by editing the promoter. Our findings reveal that direct y-globin gene promoter repression by BCL11A underlies hemoglobin switching.

BCL11A Come Target Terapeutico

Normal adult human erythroid cells ( BCL11A LCR TOACCA-IGACCA y-globin B-globin HPFH or CRISPR edited erythroid cells LCR NNNNNN-TGACCA y-globin B-globin The developmental transition between fetal and adult hemoglobin is controlled by a silencer that selectively regulates y-globin expression, suggesting a simplified control mechanism that could be amenable for manipulation in treatment of ß- hemoglobin disorders.

Loci Beta-Globinici

Umani, Topi, Polli e Pesci Zebra

A Human Chromosome 11 LCR Embryonic Fetal Adult 1 2 3 4 5 3 Gy Ay δ B B Mouse Chromosome 7 LCR Embryonic Adult 1 23456 εγ Bh1 B1 C Chicken Chromosome 1 LCR Embryonic Adult Embryonic 1 2 3 P BH BA 3 B/E enhancer D Zebrafish Chromosome 3 Adult Embryonic/Larval 1 da2 Ca1 Be1 Ba2 Ba2 de1 de3 Embryonic Larval Chromosome 12 de4 de5 Be3 Be2 LCR

Switch in Altri Modelli Animali

Percentuale di Beta-Globina Totale

Human Chicken A Percent of total ß-globin 100 Gy AV B 80 - 60 40 20 - 8 0 0 T 6 18 30 Birth 12 24 36 4 8 12 16 20. Adult Weeks post conception Age (weeks) Days post fertilisation Mouse Zebrafish B Percent of total ß-globin 100 ฿ 1 ß2 80 - 60 - εγ 40 Bh1 20 - 0 8 12 16 Birth 4 8 12 Days post fertilisation Age (days) Percent of total ß-globin 100 - Be1 Bat 80 - 60 - 40 - Be3 Be2 20 Baz 0 Hatch 8 12 16 20 24 Adult Days post fertilisation C Percent of total ß-globin 100 BA 80 60 - P 40 - 3 20 - BH 0 7 Hatch - D I geni ß-globinici embrionali sono mostrati in GIALLO, quelli fetali in ARANCIONE e i geni adulti ROSSO.

Emoglobinopatie

Talassemie

TALASSEMIE: patologie genetiche dovute a mutazioni nel gene della beta o alfa globina, che causano assenza o scarsa produzione di HbA

Emoglobinopatia C

EMOGLOBINOPATIA C: L'emoglobina C (HbC) è una variante dell'emoglobina, dovuta ad una mutazione nel gene della beta globina, che causa la sostituzione di un acido glutammico con una lisina in posizione 6 nella catena globinica.

Emoglobinopatia E

EMOGLOBINOPATIA E: L'emoglobina E (HbE) è una variante dell'emoglobina, che consiste in una mutazione nel gene della beta globina, che causa la sostituzione di un acido glutammico con una lisina in posizione 26, nella catena beta-globinica. L'HbE è, per frequenza, la seconda emoglobinopatia dopo l'emoglobina a cellule falciformi (HbS).

Emoglobinopatia S: Anemia Falciforme (SCA)

EMOGLOBINOPATIA S: ANEMIA FALCIFORME (SCA): Le drepanocitosi sono determinate dalla combinazione di due alleli del gene beta-globinico, uno dei quali almeno porta la mutazione glutammico-valina in posizione 6.

Mutazioni a Carico dell'Emoglobina

Difetti Qualitativi e Quantitativi

Difetti qualitativi Difetti quantitativi Emoglobinopatie Talassemie

Sequenze di Mutazioni

Normal beta chain ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC GTT ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC Val His Len Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Len Trp Gly Lys Val Asn Val Asp Gln Val Gly Gly Glu Ala Len Gly HbS Sickle cell (missense) ATG GTG CAC CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC GTT ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC Val His Len Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Len Trp Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Len Gly HbC (missense) ATG GTG CAC CTG ACT CCT AAG GAG AAG TCT GCC GTT ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC Val His Len Thr Pro Lys Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Len Trp Gly Lys Val Asn Val Asp Gln Val Gly Gly Gln Ala Len Gly HbThalassemia (nonsense) ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC GTT ACT GCC CTG TGG GGC TAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC Val His Len Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Len Trp Gly Stop HbThalassemia (frameshift)-AA ATG GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG GTC TGC CGT TAC TGC CCT GTG GGG CAA GGT GAA CGT GGA TGA AGT TGG TGG TGA GGC CCT GGG C Val His Len Thr Pro Glu Glu Val Gys Arg Tyr Gys Pro Val Gly Gin Gly Glu Arg Ala Stop