Aspetti teorici della cromatografia: principi e calcolo dell'efficienza

Aspetti Teorici della Cromatografia

Proteomica Nº 3
Aspetti teorici della cromatografia
Prof.Magni- Data Lezione (02/03/2021) - Autore sbobina: Daria Palomba - Revisore: Greta Bindi
L'argomento di oggi ha come punto di partenza quello
che avevamo detto in una delle varie diapositive
Campione semplice
C
€
Int
utilizzate la volta scorsa a lezione, ovvero che
Sistema di
A
rilevazione
possiamo pensare di analizzare un campione
complesso direttamente, introdurlo all'interno di un
C
B
Campione complesso - rilevatore specifico
5
min
sistema di rilevazione che generi il segnale per
l'analita o per gli analiti di nostro interesse. Questo
^ABC
possiamo farlo solo se il rilevatore è specifico, solo se
Int
rivelatore è in grado di vedere il segnale del composto
B
A
CBA
Sistema di
C
separazione
C senza che questo venga influenzato dal composto A
Sistema di
rilevazione
o B; quindi parliamo di un rivelatore che è altamente
5
min
specifico, è in grado di far generare un segnale o di
vedere solo il segnale del composto C, anche all'interno di una miscela complessa > un simile rilevatore ci
permette di analizzare direttamente il campione. Questa è una situazione però rarissima. Infatti, nella stragrande
maggioranza dei casi siamo obbligati a far precedere al sistema di rilevazione un sistema di separazione che separi
tutti i vari analiti, tutti i componenti della nostra miscela, in modo tale che entrino in tempi diversi all'interno del
sistema di rilevazione, in modo tale che questo generi un segnale specifico per ogni analita senza che i vari analiti
interferiscano l'uno con l'altro.

Nella stragrande maggioranza delle applicazioni purtroppo siamo obbligati a utilizzare un sistema di separazione.
Ovvero, per ottenere l'informazione che ci serve, per identificare e quantificare, che sono gli obiettivi della nostra
attività (noi vogliamo sapere che proteine ci sono, che peptidici ci sono, che metaboliti ci sono e vogliamo
identificare contemporaneamente anche l'informazione sul valore di concentrazione). Per poter raggiungere
questi due obiettivi noi spessissimo siamo costretti a utilizzare delle tecniche separative: in questo modo ci
introduciamo alle tecniche cromatografiche. "Tecniche cromatografiche" è un termine generico che non sta a
indicare una particolare tipologia di separazione, ma indica in maniera generica l'insieme delle separazioni.
Oggi descriveremo quelli che sono gli aspetti comuni a tutte le tecniche separative e ci riferiremo in particolare
alle tecniche cromatografiche (non faremo le tecniche elettroforetiche).

Il termine "cromatografia" o "separazione cromatografica" è stato introdotto per la prima volta all'inizio del 1900
(1903) quando la stragrande maggioranza dei ricercatori aveva un approccio empirico sulla ricerca: ad esempio,
il ricercatore aveva sul bancone una serie di sostanze/solventi ed in maniera del tutto casuale o al massimo
indirizzata a seconda delle conoscenze del tempo, provava casualmente tutto ciò che aveva. M. Tswett, un
botanico russo, stava cercando di capire quali fossero quegli analiti che potevano essere estratti dalle foglie. Lui
prese delle foglie, le mise in un mortaio, con un pestello le triturò e ci aggiunse dei vari solventi (uno di questi era
solfuro di carbonio); notò che il solfuro di carbonio ha un colore ambrato, ma è trasparente, mentre quando il
solfuro di carbonio veniva messo a contatto con le foglie che lui aveva macerato diventava opalescente, diventava
scuro. Tswett voleva cercare di capire che cos'erano quelle sostanze che lui era in grado di estrarre dalle foglie:
una delle cose che fece fu prendere una colonna in vetro. Sulla estremità inferiore ci mise un setto e la riempì
con del carbonato di calcio, una polvere biancastra. Quindi, riempì questo tubo di vetro con del carbonato dicalcio; il setto poroso sull'estremità inferiore aveva lo scopo di impedire al carbonato di calcio di uscire e poi
introdusse dall'alto questa soluzione di solfuro di carbonio scura che conteneva tutte le sostanze che erano state
estratte dalle foglie: osservò che quando lui introduceva dall'alto questa miscela, per gravità, il solfuro di carbonio
penetrava e formava una banda scura sull'estremità superiore. Notò che man mano che lui aggiungeva altro
solfuro di carbonio questa banda scura si muoveva lungo la colonna suddividendosi in tante bande variamente
colorate. Da qui, ebbe la grande intuizione che in quel modo era possibile separare i componenti presenti
all'interno di una miscela. Questo botanico russo
scrisse una lettera ai suoi colleghi dove descriveva che
cosa aveva osservato e lì per la prima volta utilizzò
questa parola "Croma graphen" (cromatografia, che
dal greco significa "scrivere il colore"), perché quello
che lui aveva visto è che era possibile vedere il colore
dei diversi analiti -> da qui la grande intuizione di
utilizzare questo modo per separare gli analiti
presenti all'interno della miscela.

Principio Generale della Cromatografia

Il principio generale di tutte le tecniche separative cromatografiche si basa su quello che abbiamo appena detto,
ovvero in un sistema cromatografico c'è una fase mobile, che è il solvente nel quale vengono disciolti gli analiti
che vogliamo separare, e questa fase ha il compito di spingere il solvente attraverso o sopra una fase stazionaria.
Quindi, all'interno di un sistema cromatografico abbiamo questi due attori: fase mobile e fase stazionaria; e gli
analiti si separano perché si ripartiscono fra le varie fasi. La separazione avviene poiché i composti presenti nella
miscela hanno diverse affinità, cioè c'è chi si attacca di più alla fase stazionaria e rimane all'interno della colonna
più a lungo, quindi si muove più lentamente, mentre c'è chi non si attacca e si muove velocemente ed esce per
primo.

In questo modo abbiamo incominciato a introdurre in maniera generica il principio delle separazioni
cromatografiche, senza però descrivere qual è il principio che sfruttano: oggi esistono diverse tecniche
cromatografiche che possiamo classificare in due modi:

• Secondo la proprietà delle fasi > parliamo di separazione cromatografica liquido-solido, gas-solido
  liquido-liquido ...
• Oppure secondo l'interazione, la modalità con cui interagiscono gli analiti con la fase stazionaria
  >
  parliamo di cromatografia a scambio ionico, cromatografia per affinità, gel filtrazione e cromatografia
  per adsorbimento.

Terminologia Cromatografica

A livello molecolare che cosa avviene all'interno di una colonna cromatografica? Questo modo di osservare quello
che accade nella realtà a livello molecolare ci torna utile per capire quali sono i fattori/attori che entrano in gioco
in una separazione cromatografica e poterli sfruttare al meglio. Terminologia:

• Eluente -> l'eluente è il solvente detto fase mobile.
• Eluato -> tutto ciò che fuoriesce dalla colonna cromatografica.
• Diluizione -> il processo di flusso lungo la colonna dei composti.Nel sistema cromatografico abbiamo un eluente che fa muovere i composti; durante questo
  movimento si eluiscono ed escono dalla colonna, quindi io li posso raccogliere.
  Come dobbiamo immaginare che avvenga questo all'interno della colonna? Vediamo
  nell'immagine uno spaccato di una colonna cromatografica dove quei grossi sassi grigi sono la
  fase stazionaria. Durante il processo di eluizione le molecole di analita si muovono lungo la
  colonna, si muovono negli spazi lasciati vuoti dalla fase stazionaria. Dobbiamo immaginare di
  vedere quello che avviene all'interno del sistema cromatografico, cioè vedere le molecole.
  Eluent
  in
  1
  Eluate
  out

Estrazione e Purificazione del Campione

Estrazione

Apriamo una parentesi. Le tecniche cromatografiche che sono delle tecniche separative potentissime, ma spesso
dobbiamo venire in loro aiuto, ovvero non è detto che il sistema cromatografico sia in grado di separare tutti gli
analiti presenti in una miscela. Quando noi parliamo di analiti noi parliamo di due cose: gli analiti che ci
interessano e gli interferenti. Il sistema cromatografico potrebbe non essere in grado di separare bene gli analiti
dagli interferenti. Cosa facciamo allora? Facciamo precedere alla separazione cromatografica una manipolazione
del campione, chiamata estrazione.

Purificazione del Campione

Si utilizzano tecniche basate su processi chimico-fisici che portano
ad un arricchimento ed all'isolamento selettivo (purificazione)
dell'analita contenuto nel campione senza alterarne le
caratteristiche.
INCREMENTO DELLA COMPLESSITA' della MATRICE
SEMPLICE
COMPLESSA
Aria < Acqua < Campioni inorganici < Campioni organici < Campioni Biologici
INCREMENTO DI COMPLESSITA' dei passaggi DI PURIFICAZIONE
Analisi diretta > Estrazione > purificazione/separazione per Cromatografia
INCREMENTO DI COMPLESSITA' delle tecniche STRUMENTAL
es: MS > GC-MS > LC-MS
Bassa risoluzione > Elevata risoluzione
Scansione > SIM.
MS -> MS/MS
Prendiamo un lucido già visto la volta scorsa. Vi
troverete nel vostro ambito professionale a
studiare delle matrici complesse. Potreste anche
dover cercare di capire quali sono le molecole
presenti nell'aria, nell'acqua, che sono matrici
semplici, o anche in campioni inorganici o
organici, dove il chimico ha sintetizzato dei
composti ... ma nella stragrande maggioranza
delle situazioni avrete a che fare con dei campioni
biologici, quindi, vi troverete a dover analizzare
dei campioni (per ottenere l'identità e la quantità)
che hanno una complessità di matrice variabile.
Qual è la conseguenza che deriva dall'incremento della complessità della matrice? Che per forza noi dobbiamo
aumentare anche la complessità dei vari passaggi, delle varie manipolazioni. All'aumentare della complessità della
matrice, spesso ci troviamo costretti a operare un processo di estrazione, che potrebbe essere sufficiente se la
matrice non è troppo complessa. Se, invece, la matrice è molto complessa il processo di estrazione non è
sufficiente e a questo processo dobbiamo abbinargli una separazione cromatografica (> incremento della
complessità dei passaggi di purificazione). Spesso all'incremento della complessità della matrice non solo
aumenta il numero di passaggi, di manipolazioni della nostra procedura analitica, ma aumenta anche la
complessità del rivelatore (si ha un generale incremento di complessità delle tecniche strumentali). Per una
matrice semplice posso usare un rivelatore UV visibile o usare un elettrochimico, ma all'aumentare della
complessità questo può non bastare più, devo cercare di usare un rivelatore UV visibile a doppia lunghezza d'onda
che mi permetta di ottenere uno spettro di assorbimento, oppure usare un rivelatore molto complesso come lo
spettrometro di massa. Quindi, all'aumentare della complessità della matrice potremmo essere costretti ad
aumentare il numero di passaggi di purificazione per separare e aumentare la complessità del rivelatore e delle
tecniche strumentali.