Diagnostica molecolare in microbiologia: tecniche e sistema FilmArray

Diagnostica Molecolare in Microbiologia

Dott.ssa Roberta Soldani U.O.C. Microbiologia e Virologia A.O. San Camillo Forlanini- Roma

Introduzione alla Diagnostica Molecolare

Attualmente, per la rilevazione dei microrganismi patogeni accanto alle metodiche tradizionali rappresentate:

• dall'esame colturale
• l'esame diretto al microscopio
• le prove biochimiche

· [ gli immunodosaggi sierologici sono disponibili tecniche di amplificazione molecolare che hanno assunto un ruolo determinante nella diagnostica microbiologica.

Diagnostica Molecolare in Microbiologia Clinica: Quando Applicarla

Per diagnostica molecolare in microbiologia clinica si intende, in senso stretto, la possibilità di identificare un microrganismo in base ad una o più sequenze geniche specifiche. La diagnostica molecolare si rivela spesso più sensibile e/o più specifica dei metodi tradizionali e si ricorre sempre più ad essa quando:

1. il microrganismo sia difficilmente od affatto coltivabile,
2. quando cresca molto lentamente in vitro,
3. quando la sua manipolazione possa essere troppo pericolosa per l'operatore e/o per la comunità
4. quando, infine, il costo di una diagnosi tradizionale sia più elevato di quello di una diagnosi molecolare.

Vantaggi dell'Indagine Molecolare

• Rapidità di esecuzione e di risposta
• Identificazione di geni codificanti per resistenze
• Applicabilità anche a materiali con flora polimicrobica
• No tempi di crescita microbica
• Automazione

Svantaggi dell'Indagine Molecolare

• falsi-positivi: contaminazione "crociata" del campione con DNA controllo o proveniente da altri campioni;
• falsi-negative: presenza di inibitori enzimatici;
• non fornisce informazioni sulla vitalità microbica;
• scarsa specificità: cross-reattività tra specie differenti;
• Maggiore complessità
• Costi elevati
• No antibiogramma

Identificazione Molecolare

Un metodo molto specifico e sensibile per la identificazione dell'agente patogeno prevede la ricerca di caratteristiche sequenze di DNA o RNA (specie-specifiche). Tali tecniche di biologia molecolare rappresentano strumenti diagnostici molto potenti, in quanto ci consentono:

• la ricerca e la identificazione rapida di patogeni umani anche direttamente dal campione biologico
• la ricerca di microrganismi a lenta crescita, difficilmente coltivabili, oppure non coltivabili e/o non necessariamente vivi (ad esempio a seguito di terapie)
• la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici
• la ricerca di determinanti genici codificanti per la resistenza agli antibiotici, sebbene non possano sostituirsi ai saggi di antibiotico-sensibilità.

Metodiche Tradizionali e Innovative

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• Esame diretto dopo colorazione di Gram (sensibilità 60-80%)
• Test al latex per evidenziare antigeni (sensibilità 60-90%)
• Esame colturale (sensibilità 90-100%)
• NATs (Nucleic Acid Amplification Technology)
• Nested- PCR
• Multiplex PCR- immunoassay
• Real-Time PCR Single-step PCR assay
• MLST (multilocus sequence typing)
• LCR (ligase chain reaction) sensibilità e specificità >90%

Esempi di Applicazione alla Microbiologia Clinica

Tubercolosi (TBC)

TBC: Per la formulazione di una corretta diagnosi di tubercolosi nell'uomo, ossia la ricerca, l'isolamento e l'identificazione di Mycobacterium tubercolosis (MTB), le procedure standardizzate richiedono un lungo periodo di attesa (6-10 settimane) che non consente la necessaria precoce applicazione di misure di controllo adeguate (isolamento dei malati con tubercolosi infettante, precoce inizio della terapia, ecc.). Il riemergere della tubercolosi ha fatto sì che venissero affinati i test tradizionali e venissero sviluppati nuovi test che, in caso di sospetto clinico, potessero offrire una risposta sempre più rapida ed affidabile. La sensibilità dell'esame colturale LJ è compresa tra 67 e 90%, mentre quella delle tecniche molecolari è compresa tra 93 e 96%, queste ultime possono, quindi, essere usate come conferma nell'analisi dei campioni negativi al vetrino, qualora siano ottenuti da pazienti immunodepressi o con forte sospetto clinico di malattia da MTB.

Meningite

MENINGITE: Accanto alle tradizionali tecniche di caratterizzazione fenotipica dei meningococchi, eseguite su isolati colturali, sono state sviluppate diverse tecniche di tipizzazione molecolare che possono essere eseguite direttamente su campioni clinici (CSF, sangue, etc.). Le potenzialità delle tecnologie innovative nella diagnostica delle meningiti batteriche sono dimostrate da saggi come la PCR multiplex che permette contemporaneamente di identificare diversi patogeni (Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, e Streptococcus pneumoniae) nello stesso campione clinico (CSF, plasma, siero, sangue intero), utilizzando primers specifici per 2 o più sequenze targhet nella stessa reazione. Si tratta di una tecnica estremamente utile non solo per la notevole accuratezza diagnostica (elevata sensibilità e specificità) ma anche perché permette di discriminare all'interno di ciascuna specie patogena differenti sierogruppi, sierotipi e tipi.

Sistema Genexpert

Sistema integrato e completamente automatico di diagnostica molecolare rapida in Real Time PCR, trova applicazione nell'identificazione di numerose specie batteriche e virali e nell'identificazioni di sequenze codificanti per resistenze. il Test a cartucce Genexpert, ora denominato Xpert MTB/RIF, è in grado di individuare il bacillo della Tubercolosi in meno di due ore. Il suo utilizzo è aumentato, in particolare nei paesi in via di sviluppo dove l'infezione ha dimensioni significative, di circa il 50% ogni anno da quando la Cepheid l'ha messo in commercio nel 2011. Si tratta di una grande innovazione che riduce drasticamente i tempi di attesa per la diagnosi. I progetti pilota di Medici Senza Frontiere in Zimbawe e Swaziland hanno confermato che grazie a questa tecnologia, il tempo di attesa tra la raccolta del campione dal paziente e l'inizio del trattamento si è ridotto del 79% passando incredibilmente da 66 giorni a 14 di media. Il test, che sfrutta un sistema di PCR rapido, è inoltre in grado di verificare se il ceppo di bacilli della tubercolosi sia o meno resistente al più comune farmaco utilizzato per il trattamento della tubercolosi, la Rifampicina.

Genexpert: Preparazione Tecnica

• 1. Estrarre una cartuccia dalla confezione.
• 2. Verificare che la provetta di trasporto del campione di analisi sia chiusa.
• 3. Miscelare il campione di analisi capovolgendo rapidamente la provetta di trasporto per 5 volte. Aprire il tappo della provetta di trasporto del campione di analisi.
• 4. Aprire il coperchio della cartuccia.
• 5. Estrarre la pipetta di trasferimento dalla confezione.
• 6. Schiacciare a fondo il bulbo superiore della pipetta di trasferimento e quindi introdurre la punta della pipetta nella provetta di trasporto del campione di analisi (vedere la Figura 4). Figura 4. Pipetta di trasferimento
• 7. Rilasciare il bulbo superiore della pipetta per riempirla prima di estrarla dalla provetta. Una volta riempita la pipetta, il campione in eccesso passerà al bulbo del serbatoio di troppopieno della pipetta (vedere la Figura 4). Verificare che la pipetta non contenga bolle d'aria.
• 8. Per trasferire il campione alla cartuccia, schiacciare a fondo ancora una volta il bulbo superiore della pipetta di trasferimento per svuotare il contenuto della pipetta (300 ul) nell'apertura grande (camera per il campione) della cartuccia. Gettare la pipetta usata.
• Importante Iniziare il test entro 30 minuti dall'introduzione del campione nella cartuccia.

A B GeneXpert ...... Camera per il campione (apertura grande) Schiacciare qui Pipetta Bulbo del serbatoio di troppopieno Campione Figura 4. Pipetta di trasferimento

1 Sputum liquefaction and inactivation with 2:1 sample reagent MTB/RIF 2 Transfer of 2 ml material into test cartridge 8 Printable test result MTB/RIF MTBRF -- -- -- Assay Name MTB-RIF Test Result MTB DETECTED LOW. RIF Resistance NOT DETECTED 3 Cartridge inserted into MTB-RIF test platform (end of hands-on work) 4 Sample automatically filtered and washed 5 Ultrasonic lysis of filter-captured organisms to release DNA 6 DNA molecules mixed with dry PCR reagents 7 Seminested real-time amplification and detection in integrated reaction tube Time to result, 1 hour 45 minutes

Piattaforma Filmarray

La piattaforma integrata FilmArray® è un sistema chiuso, estremamente rapido e semplice che svolge in maniera automatica, all'interno un pouch monouso compatto, le reazioni di estrazione, purificazione ed amplificazione dell'acido nucleico batterico presente in un campione biologico/clinico non processato. Si avvale di una PCR Multiplex per cui con una singola corsa si ricercano più patogeni contemporaneamente. Procedura sperimentale del test FilmArray®: Il test inizia con l'iniezione di circa 1 ml di Hydratation Solution nel pouch, per reidratare i reagenti liofili in esso conservati. Segue il prelievo con una pasteur sterile di una aliquota di campione biologico (intero o diluito nel tampone di eluizione) che viene iniettati nel pouch, il quale viene successivamente caricato nello strumento FilmArray® . Si inserisce l'ID del pouch, leggendone il barcode, si digitano i dati del paziente ed infine si avvia la corsa. Lo strumento FilmArray® svolge in maniera automatica l'analisi dei risultati, che vengono forniti in circa 1 ora.

Filmarray: Principio di Funzionamento

In uno specifico serbatoio del pouch sono concentrati in forma liofila tutti i reagenti necessari per la preparazione del campione e l'amplificazione ed identificazione del target batterico. La pellicola inferiore del FilmArray® è costituita da "bolle" e canali che rappresentano specifiche stazioni in cui si verifica l'intero processamento del campione, in particolare:

• Lisi cellulare mediante biglie di ceramica;
• Purificazione dell'acido nucleico mediante biglie magnetiche;
• Primo stage di multiplex PCR;
• Array costituito da 102 pozzetti in cui si verifica un secondo stage di nested PCRs.

Durante la prima multiplex PCR si verificano simultaneamente molteplici reazioni di amplificazione in cui intervengono dozzine di primers "esterni". Gli ampliconi della prima PCR vengono diluiti (100X) e, all'interno di ogni pozzetto dell'array, inizia una seconda fase di amplificazione (denominata inner nested PCR) realizzata da set di primers "interni" che sono disegnati per amplificare specifiche sequenze target contenute negli ampliconi prodotti nella prima fase di amplificazione. Successivamente verranno rilevati i prodotti della seconda reazione di PCR in real-time.