Microbiologia generale: storia, microrganismi e malattie

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA

La microbiologia generale è una branca della scienza che studia i microrganismi, ovvero tutti quegli organismi che si trovano al di sotto dell' ordine dei micron (10^-6 m). A questa regola si presentano alcune eccezioni, come i cianobatteri, batteri con cellule dalle dimensioni 50 um e che formano delle colonie.

STORIA DELLA MICROBIOLOGIA

Prima testimonianza dei microrganismi

Antoine Van der Leeuwenhoek, mercante di tessuti, mise delle gocce d'acqua sotto le lenti di ingrandimento e vide degli organismi che si muovevano in maniera precisa nell'acqua e li rappresenta, dando luogo alla prima rappresentazione e testimonianza dell' esistenza di microrganismi.

Pasteur-Redi e teoria della generazione spontanea

Pasteur, chimico, ebbe un ruolo importantissimo per lo sviluppo della microbiologia come branca della scienza. Infatti, egli fu non solo in grado di dimostare che la fermentazione fosse un processo biotico in quanto è coinvolto un organismo lievito, ma anche smentire la teoria della generazione spontanea. La teoria della generazione spontanea era una teoria largamente diffusa secondo cui la vita potesse autogenerarsi a partire da altro materiale per via di un fenomeno chimico o fisico(ex carne->larve di mosca) Per smentire questa teoria, Redi effettuò un esperimento: prese tre barattoli con della carne di cui:

• Barattolo con carne aperto: in questo barattolo passa sia l'aria che gli organismi. Questo barattolo serve per il controllo positivo in quanto serve a verificare se si sviluppano davvero le mosche
• Barattolo con carne coperto da garza: in questo barattolo passa solo l'aria e non le mosche. Questo barattolo serve a verificare se il fenomeno è biologico o chimico. Se il fenomeno è chimico, con solo il passaggio dell' aria si sarebbero dovute sviluppare le mosche, mentre, se fosse stato un fenomeno biologico, non si sarebbe sviluppato alcuna forma di vita.
• Barattolo con carne chiuso con un tappo: in questo barattolo non passano ne i microrganismi né l'aria. Questo barattolo serve per il controllo negativo in quanto serve a verificare se le mosche non si sviluppano in ogni caso.

Dopo aver aspettato qualche giorno, Redi vide i seguenti risultati: nel barattolo chiuso, non si sviluppa alcuna mosca, nel barattolo aperto si sviluppano delle larve di mosca e mosche, mentre nel barattolo coperto da garza non si sviluppavano larve nella carne. Per cui, questo esperimento conferma che è un fenomeno biologico, ma venne altamente criticato perché le condizioni non erano ideali.

Pasteur smontò definitivamente la teoria dell' autogenerazione attraverso un esperimento. Prese una beuta contenente una coltura sterile (coltura riscaldata in modo da evitare possibili contaminazioni). Da qui, se si lascia la beuta in verticale, i microrganismi contenuti nell' aria si svilupperanno solo sul beccuccio, mentre, se si piega la beuta in modo che il liquido si contamini con i microrganismi sul beccuccio, si creano. Quindi, i microrganismi si sviluppano per fenomeni biologici e non spontaneamente

Esperimento di Francesco Redi tappo garza mosca carne barattolo Esperimento di Luis Pasteur Dust and microorganisms trapped in bend Open end Long time (b) Liquid cooled slowly Liquid remains sterile for many years FLIES MEAT NET EGGS NO MAGGOTS MAGGOTS Esperimento di Luis Pasteur Short time (c) Flask tipped so microorganism-laden dust contacts sterile liquid Microorganisms grow in liquid

Studi su malattie causate da organismi patogeni

Dopo questa fondamentale scoperta, si comprese che i microrganismi fossero responsabili dell' insorgere di malattie (ex separando i bachi da seta malati che producevano poca seta da quelli sani, si evitava che anche gli altri si contagiassero) o della contaminazione del cibo. Per ridurre le contaminazioni da microrganismi, Pasteur creò le procedure di sterilizzazione utili ad uccidere tutti i microrganismi patogeni presenti in un alimento (ex la pastorizzazione) o presenti su strumenti di chirurgia o chirurgo (no infezioni). Per studiare ed identificare tutti i microrganismi patogeni, R.Koch stabilì i postulati di Koch:

1. Un microrganismo deve essere sempre presente in una data malattia
2. Il microrganismo deve poter essere isolato dall' ospite malato e coltivato in coltura pura
3. La malattia deve ripresentarsi se si effettua un inoculo della coltura pure in individuo sano
4. Il microrganismo deve poter essere re-isolato dal nuovo ospite infettato

Quindi: per identificare un nuovo microrganismo si deve verificare: se è presente in una malattia specifica, se può essere isolato dal paziente malato, coltivato in coltura e iniettato in un individuo sano ammalandolo.

Correlazione tra ospite e patogeno: colera dei polli (1880)

Nel 1880, si era diffusa tra i polli una malattia nota come "colera dei polli" che portava alla loro morte. Per vedere quale microrganismo fosse responsabile dell' insorgenza della malattie, si fece un esperimento: si prese una beuta con coltura liquida contenente sospensione batterica del batterio considerato resposabile dell' insorgere della malattia e si inocula una buona quantità di microrganismi nel pollo sano: il pollo prende il colera e muore. Poi, dal pollo morto si prelevano dei batteri del colera, si mettono in coltura e si inoculano nel pollo: il nuovo pollo muore. Tuttavia, se l'esperimento viene effettuato con una coltura non rinnovata da diverse settimane (formata da batteri morti), pollo non si ammala e, se si inietta in questo pollo una coltura fresca, il pollo vive ancora. Così, è stata scoperta l'immunità acquisita dall' organismo in quanto alcune componenti extracellulari rilasciati dai batteri morti vengono riconosciuti dal sistema immunitario e, quando il batterio vivo si ripresenta, sono in grado di riconoscerlo e contrastarlo.

Colera dei polli (1880) Come scoprire se un batterio è causa di una malattia e come Coltura fresca contrastarne l'azione ... Sospensione batterica Terreno di coltura Pollo Pollo morto Inoculo Coltura non rinnovata per alcune settimane Isolamento batteri Coltura fresca Inoculo Inoculo Inoculo Pollo immunizzato Pollo morto

Pasteur e le malattie causate da microganismi

• il vaccino antirabbico Studiando gli individui affetti da rabbia, Pasteur vide che era più facile infettare ulteriori animali se si prelevavano le cellule dell' ospite malate dal midollo spinale piuttosto che dalla saliva. Poi, se si fa essiccare e si espone ai vapori di sodio questa materia cerebrale, si ottiene un materiale incapace di far sviluppare la malattia ma che, quando iniettato in un animale sano, può evitare l'insorgere di malattie se dovesse incontrare l'organismo patogeno. Inoltre, egli vide che, iniettando l'essicato in bambini morsi da animali rabbiosi ma non malati, i bambini non sviluppavano la malattia. Così, si ha il primo vaccino.
• Carbonchio e antrace Studiando due malattie causate dallo stesso microrganismo (Bacillus atrachis), ovvero il carbonchio (patologia animale, in particolare erbivori, che porta a febbre e alla morte dell' individuo, ed inoltre, all' autopsia presenteranno una milza nera e ricca di bacilli e sangue scuro) e antrace (patologia umana che può presentarsi soltanto quando gli individui sono a contatto prolungato con animali infetti, in quanto il contagio animale-uomo è molto difficile e contagio uomo-uomo è difficile). Quando gli animali sono esposti ad una forma attenuata del bacillus atrachis, essi sono in grado di sviluppare una resistenza alle tossine che causano questa malattia.

Flenning e il primo antibiotico

Un antibiotico è una sostanza chimica che viene naturalmente prodotta da alcuni microrganismi per contrastare la proliferazione di microrganismi o ucciderli. Il primo antibiotico fu scoperto da Flenning quando, in seguito alla contaminazione della coltura con Penicillium notatum, una muffa, si notò un alone nel quale non cresceva nessun microrganismo. Questo perché questa muffa produce l'antibiotico pennicillina che impedisce la crescita dei microrganismi.Per verificare l'esistenza di altri antibiotici, si prende la colonia in coltura liquida, si preleva e si mette in coltura col batterio per vedere se cresce.

Coltura fresca

I MICRORGANISMI

I microrganismi, come già menzionato prima, sono organismi risalenti a 3,5 miliardi di anni fa, sono organismi le cui dimensioni vanno al di sotto dell' ordine dei micron (10^-6). Questi vengono molto utilizzati nel campo delle biotecnologie in quanto: sono facili da gestire in laboratorio, si possono avere in grandi quantità e hanno tempi di riproduzione molto brevi. Infatti, un microrganismo si ha un tempo di generazione di 20 minuti. Questo tempo di generazione medio è stato calcolato mettendo a confronto le curve della cinetica di crescita che diversi organismi possedevano.

Curva di cinetica di crescita

Una curva di cinetica di crescita è una curva all' interno della quale si distinguono tre fasi: fase lag, in cui le cellule microbioche si trovano in sospensione di glicerolo e quindi si riprogrammano per utilizzare tutti i nutrienti presenti nel nuovo terreno e riavviare il metabolismo, la fase di crescita esponenziale in cui si ha un aumento del numero della popolazione di tipo esponenziale o logaritmico, fase stazionaria in cui la popolazione microbiotica smette di crescere perché il terreno ha esaurito tutti i nutrienti. Da questa fase in poi, i microrganismi o sfruttano altri materiali per ottenere nutrienti dando il via ad una seconda fase esponenziale, oppure i microrganismi presenti in coltura muoiono in quanto non ci sono più nutrienti necessari per il proprio sostantamento. Da questa curva, si possono ricavare: velocità massima di crescita, ovvero la velocità che la biomassa impiega per espandersi nel tempo (v= (massa al tempo t1- massa al tempo t2)/ tempo impiegato) e tempo di rigenerazione, ovvero il tempo che la biomassa impiega per raddoppiarsi. Quest'ultimo è strettamente dipendente dalle condizioni in cui la colonia si trova: se la colonia si trova in condizioni ottimali, la velocità è molto alta il tempo è minimo, mentre se le condizioni non sono ottimali, la velocità è nettamente minore. Quando crescono su terreno solido, si formano delle colonie, degli accumuli di biomassa microbiotica.

Esercizio

Quanti batteri si trovano in un terreno dopo 10h se all' inizio ce ne sono 10 sapendo che il tempo di duplicazione è di 20 minuti? Dai dati del problema, si individuano i seguenti dati: N0 (numero iniziali di microbioti, 10), tempo iniziale (t0), tempo finale (t1) e tempo di duplicazione (td, 20 minuti). Quindi, si deve individuare nf (numero finale). risolvere questo problema, è necessario applicare la seguente formula: Nf = NO * 2tđ Quindi, applicando il problema:

• Si convertono le ore in minuti (1h=60 minuti quindi 10h=600 minuti)
• Nf= 10 * 2^(30)

Verificare la crescita di coltura

Per verificare la crescita di una coltura microbica, si possono usare tre metodi diversi:

1. Metodo con spettrofotometro: questo metodo prevede l'utilizzo dello spettrofotometro, strumento in grado di rilevare l'assorbanza del campione da analizzare (in questo caso la coltura). Infatti, utilizzando una lunghezza d'onda di 600mm (lunghezza d'onda che le cellule assorbono maggiormente), è possibile misurare sia la crescita che il numero di colonie che si sono formate. Per esempio, se si preleva 1ml del brodo di coltura originale e si fanno una serie di diluizioni, si avrà un numero sempre minore di colonie (diluendo 3 volte, 10^3, si ottengono 159 colonie; diluendo 4 volte, 10^ 4, si ottengono 16 colonie; diluendo 5 volte, 10^5, si ottengono 2 colonie e così via fino a quando non se ne ottengono zero). Il numero di colonie ottenute viene definito CFU (colony farming units). Nell'esempio precedente nella diluizione 10^5, CFU = 2.

ESERCIZIO

Se seminando 1 ml di soluzione si ottengono 159 colonie, la concentrazione è identica se si seminano 100 ml e si ottengono 16 colonie? Per risolvere questo problema, si fa così:

• Dividere il numero di CFU ottenutoper il numero di ml seminati 16/10^-1 = 160 CFU
• moltiplicare per l'inverso della diluizione 160 x 10^3=1.60 x 10^5

1. Metodo con peso secco: Questo processo prevede che venga prelevata una aliquota della coltura e si centrifuga in modo che la biomassa precipiti, poi si elimina il sovranatante e si fa essiccare il pellet, ottenendo così il peso netto o peso secco.
2. Metodo con diluizioni seriali: il metodo prevede l'utilizzo di diluizioni seriali, ovvero una serie di diluizioni (ovvero si prende 1 ml del campione originale e si mette in una nuova soluzione, poi dalla nuova soluzione si preleva 1 ml e si mette in un'altra soluzione ancora e così via). Alla fine del