Appunti di Istologia: studio dei tessuti e composizione del sangue

Istologia: Tecniche e Strumenti per l'Indagine

ISTOLOGIA= dal greco istós (=tessuto), è lo studio dei tessuti Gli organismi pluricellulari sono formati da: CELLULE + MATRICE EXTRACELLULARE TESSUTO= organizzazione MORFOFUNZIONALE di cellule e di matrice= insieme di cellule che lavorano in sinergia e che sono morfologicamente simili e con la stessa funzione

Livelli di Organizzazione Biologica

1. ATOMI, MOLECOLE, ORGANULI
2. CELLULE
3. TESSUTI (= + cellule insieme)
4. ORGANI (= + tessuti insieme)
5. APPARATI (= + organi insieme)

la diversità di forma e funzione è frutto del'espressione differenziata dei geni, determinata dal fatto che alcuni geni restano attivi

Differenziamento Cellulare e Tipi di Tessuto

Il differenziamento cellulare porta alla formazione dei TESSUTI Nel nostro corpo ci sono 4 tipi di tessuto:

1. TESSUTO EPITELIALE
2. TESSUTO CONNETTIVO
3. TESSUTO MUSCOLARE
4. TESSUTO NERVOSO

Es. CUTE= organo formato da EPIDERMIDE E DERMA ISTOLOGIA= materia morfologica, si propone di studiare la struttura morfologica avvalendosi di metodiche atte all'identificazione e caratterizzazione delle strutture cellulari e tissutali e delle loro correlazioni funzionali. La FORMA è finalizzata e strettamente correlata alla funzione delle cellule del tessuto. ("La forma è l'immagine plastica della funzione") ("La forma segue la funzione")

Dimensioni e Limite di Risoluzione

DIMENSIONI LIMITE DI RISOLUZIONE (d) = distanza minima fra due punti vicini percepibili come distinti LIMITE DI RISOLUZIONE (d) OCCHIO UMANO = 0.1mm

Microscopio Ottico

MICROSCOPIO OTTICO/MICROSCOPIO A LUCE TRASMESSA= Formato da una lampadina alla base, un tavolino porta oggetto, 3 obiettivi con diversi ingrandimenti, un oculare. LIMITE DI RISOLUZIONE (d) = metà della lunghezza d'onda della luce utilizzata. (0.2 micron) Il potere risolutivo determina il livello del dettaglio contenuto nell'immagine.

Microscopio Elettronico a Trasmissione

MICROSCOPICO ELETTRONICO A TRASMISSIONE= Utilizzato per vedere nel dettaglio organuli delle cellule. Gli elettroni hanno un percorso rettilineo, mantenuti sottovuoto in una colonna del microscopio. Gli elettroni colpiscono il campione e vengono deviati, gli elettroni deviati provocheranno un cono d'ombra alla base del microscopio, sullo schermo fluorescente. La visione è quindi in bianco e nero.Al moto degli elettroni è associata una lunghezza d'onda molto ridotta, ergo il limite di risoluzione sarà piccola. LIMITE DI RISOLUZIONE (d)= 0.4 nm

Microscopia Crioelettronica

MICROSCOPIA CRIOELETTRONICA= Ha migliorato il limite di risoluzione del microscopio. Attraverso il freddo, si sono evitati i danni da surriscaldamento del campione, quindi i campioni vengono preservati. Questo tipo di microscopio viene utilizzato per analizzare le BIOMOLECOLE (proteine, DNA, RNA, ... ) È stato utile per capire la struttura e la morfologia della proteina S (Spike) negli studi di SARS-Cov-2.

Microscopio Elettronico a Scansione

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE= Meno performante, fa una scansione superficiale del preparato ma ne manda una scansione 3D al computer, che aiuta a ricostruire l'architettura dell'organo.

Cellule Staminali

CELLULE STAMINALI= cellule MULTIPOTENTI (=si possono trasformare in + tipi cellulari) che permangono nell'adulto per la rigenerazione di tessuti, le troviamo nel tessuto adiposo o nel midollo osseo.

Microscopio Confocale

MICROSCOPIO CONFOCALE= Microscopio conveniente in quanto fa sezioni ottiche del campione ed elimina i pixel non a fuoco, ricostruendo un'immagine nitida al computer.

Metodi di Fissazione

METODI DI FISSAZIONE FISSARE= fermare ogni attività vitale della cellula, compresa l'attività degli enzimi autolitici che deteriorano la cellula, allo scopo di mantenere cellule e tessuti come fossero allo stato vitale Se il fissativo è CHIMICO, consiste nell'immersione del campione nel fissatore, il tempo d'immersione dipende dalla dimensione del campione e dal tempo di azione del fissatore (2-24h).

Tipi di Fissatori

• FORMALINA= fissatore chimico che agisce sulle proteine formando legami crociati, inattivando l'attività enzimatica delle proteine (circa 24 ore)
• ALCOL= fissatore chimico che si sostituisce all'acqua nella cellula, disidratando la cellula (togliendo la vita alla cellula)
• CONGELAMENTO= è un metodo rapido (circa 10 minuti) utilizzato in ambito chirurgico per biopsie. Il congelamento deve essere istantaneo, l'acqua deve vetrificare, quindi congelando con CO2 o immersioni in azoto liquido. (-195ºC)

Per essere efficiente, il metodo di fissazione deve essere attuato VELOCEMENTE per evitare il deterioro della cellula. Il tessuto nervoso è quello più sensibile da fissare, bisogna agire rapidamente onde evitare che il tessuto diventi illeggibile. (20 secondi).

Microtomi e Inclusione

MICROTOMI= affettatrici molto precise per tessuti (M.O .= 4-10 micron; M.E .= qualche decina di nanometro). Per tagliare il tessuto deve essere indurito mediante INCLUSIONE, in quanto i tessuti umani sono (= infiltrare materiale diottico liquido che solidifichi il campione) Per la microscopia luce viene utilizzata la PARAFFINA, una cera solida a temperatura ambiente, liquida a 50ºC.Nei laboratori istologico la paraffina viene messa dentro vaschette di metallo su una stufa, in cui poi verrà immesso il campione sciacquato dal fissatore. Dentro il blocchetto di paraffina solidificato si troverà il campione, in modo tale da poterlo "affettare". In caso di fissazione con l'alcol il tessuto sarà già disidratato. Il campione congelato è un campione consistente, pronto per essere affettato.

Criostati

CRIOSTATI= microtomi che mantengono il campione congelato a -20ºC, pronto per affettarlo. Per la microscopia elettronica non basta la durezza della cera, ma è necessaria una RESINA PLASTICA. I tessuti sono quasi incolori e privi di contrasto, prima dell'osservazione il tessuto deve essere COLORATO.

Colorazione

Tipi di Coloranti

• COLORANTI ACIDI
• COLORANTI BASICI

Utilizzo in sequenza di EMATOSSILINA (colorante basico BLU) -- EOSINA (colorante acido ROSSO) EMATOSSILINA= colorante basico che colora di BLU le strutture BASOFILE EOSINA= colorante acido che colora di ROSSO le strutture ACIDOFILE Risultano BASOFILE le sostanze che di per sé sono ACIDE. Risultano ACIDOFILE le sostanze che di per sé sono BASICHE. Es. DNA= il nucleo cellulare sarà colorato di BLU, in quanto BASOFILO. Il TESSUTO EPITELIALE NON è vascolarizzato, deve essere quindi sempre accostato al tessuto connettivo dal quale ottiene sia l'irrorazione vascolare per diffusione che nutrimento. (OSSERVAZIONE IMMAGINE CAMPIONE MUCOSA INTESTINALE)

Tonache e Villi Intestinali

TONACHE= ORGANO formato da EPITELIO + CONNETTIVO (cavità orale, nasale, intestinale, uterina ... ) Una cavità interna in comunicazione con l'esterna è rivestita da una TONACA MUCOSA. la tonaca mucosa intestinale si trova nei VILLI intestinali, ciò aumenta la superficie di assorbimento, favorendo quest'ultima. VILLO=espansione digitiforme della mucosa intestinale, si vedono ad occhio nudo. Le cellule dell'epitelio si chiamano ENTEROCITI (decina di nm), specializzati nella funzione assorbente. Gli enterociti sono formati da MICROVILLI, che si vedono solo al microscopio elettronico, che aumentano a loro volta la superficie utile d'assorbimento. A mantenere la forma dei microvilli contribuisce la proteina acidofila detta ACTINA. Alcune sostanze NON SI COLORANO né con coloranti basici né con coloranti acidi:

• LIPIDI
• GLUCIDI

Il muco è costituito da ZUCCHERI, ergo non si colora. In caso di fissazione le zone a contenuto glucidico si perdono perché idrosolubili. (OSSERVAZIONE IMMAGINE CAMPIONE TESSUTO MUSCOLARE) L'ACIDOFILIA nel sarcomero è data dall'organizzazione delle fibre di ACTINA E MIOSINA.(OSSERVAZIONE IMMAGINE CAMPIONE PANCREAS ESOCRINO) Il citoplasma circostante e il nucleo sono BASOFILI. BASOFILIA CITOPLASMATICA= indica al 99%presenza di RNA che forma RIBOSOMI (=sede della sintesi proteica), quindi equivale alla PRODUZIONE DI PROTEINE. Il pancreas esocrino produce ENZIMI, quindi PROTEINE.

Isto chimica

Colorazioni Specifiche

• COLORAZIONE PAS: per gli ZUCCHERI Le strutture PAS positive hanno generalmente un colore MAGENTA. Il FEGATO è una struttura PAS positivo, in quanto organo d'immagazzinamento del glicogeno

Immunoistochimica

IMMUNOISTOCHIMICA Branca dell'istochimica che consente l'identificazione dei costituenti cellulari tissutali come ANTIGENI in situ, utilizzando ANTICORPI. Il complesso ANTIGENE-ANTICORPO che si forma non è visibile, è necessario servirsi di MARCATORI:

• MARCATORI FLUORESCENTI
• MARCATORI ENZIMATICI (PEROSSIDASI, utilizzato + spesso)

Citologia

Teoria Cellulare

TEORIA CELLULARE (1839, THEODORE SCHWANN) " La cellula è l'unità strutturale e funzionale di ogni organismo vivente; ogni cellula deriva da un'altra cellula. La cellula è la struttura più piccola capace di vita autonoma" Ogni cellula ha FORME e DIMENSIONI diverse. La cellula acquisisce la sua forma nel momento in cui acquisisce la sua funzione = DIFFERENZIAMENTO= attivazione di geni specifici. In una cellula ancora primitiva vengono attivati i geni specifici per la funzione. Durante lo sviluppo embrionale i blastomeri (=cellule) sono identici fra loro. In un momento le cellule iniziano a plasmarsi a seconda della loro funzione di destinazione. Il differenziamento è inversamente proporzionale alla POTENZIALITÀ= più una cellula è differenziata, meno potenziale avrà. Il differenziamento è inversamente proporzionale alla PROPENSIONE MITOTICA (=tendenza a dividersi)= più una cellula è differenziata, meno tenderà a dividersi. Differenziamento 0= possibilità infinite di morfologia, funzionalità e potenzialità. Es. NEURONI= cellule differenziate al punto tale che svolgono solo una e una sola funzione.

Cellula Eucariotica

CELLULA EUCARIOTICA: nucleo doppia membrana Dcontiene citoplasma sistema di membrane interne-Des. COMPARTIMENTAZIONE attività chimiche es. METABOLISMO CELLULARE

Membrana Plasmatica

• MEMBRANA PLASMATICA/MEMBRANA CELLULARE/PLASMALEMMA: Permette il passaggio di sostanze e nutrienti dall'ambiente extracellulare a quello intracellulare. La membrana ha uno spessore di 8 nm, si vede infatti solo al microscopio elettronico. COMPOSIZIONE CHIMICA: La membrana plasmatica ha una composizione di tipo GLICOLIPOPROTEICA= formata da ZUCCHERI, FOSFOLIPIDI e PROTEINE. D 2 strati di fosfolipidi (code acidi grassi verso interno" (testa gruppi fosfato verso esterno) LD3 tipi : trasporto di molecole; recettore; geicoproteine Le PROTEINE appoggiate alla membrana possono essere:
  1. ESTRINSCHE, quelle che si inseriscono nella parte esterna della membrana
  2. INTRINSECHE, quelle che si trovano dentro la membrana
  3. TRANSMEMBRANA, quelle che attraversano la membrana

  I GLUCIDI stanno solo sul versante extracellulare e costituiscono il GLICOCALICE, che avrà una funzione in relazione alla sua posizione di intervenire nel riconoscimento e nell'interazione delle cellule. I glucidi costituiscono gli ANTIGENI DI SUPERFICIE, hanno una funzione nell'interazione con le cellule dell'organismo; alcuni antigeni sono comuni, altri sono caratteristici della persona. I FOSFOLIPIDI formano un MODELLO A MOSAICO FLUIDO in quanto le proteine sono libere di muoversi nel doppio strato fosfolipidico, attraverso delle ZATTERE LIPIDICHE.